一、转基因水稻株系的纹枯病抗性分析（论文文献综述）
张朝阳[1]（2021）在《水稻miR535-3p和miR444b.2在抗纹枯病过程中的功能与分子机制》文中提出水稻纹枯病（Rice sheath blight）是水稻生产上最为严重的病害之一,给水稻的产量和品质带来严重影响,随着农业生产中氮肥使用量的增加、矮秆多分蘖高产品种的推广以及栽培模式的改变,造成田间纹枯病菌不断富集,危害程度日趋加重。由于纹枯病的发生受田间气候因素影响大,且病原物立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）的寄主范围广、腐生性强,能以菌核形式在自然界中长期存活,从苗期至穗期均可以引起植株发病,给生产和防治带来了巨大的挑战。本研究通过构建Osa-miR535-3p和Osa-miR444b.2敲除和过表达材料,分析miRNA在水稻响应立枯丝核菌侵染过程中的功能;构建转录组测序文库,挖掘受Osa-miR535-3p和Osa-miR444b.2调控显着的激素信号转导途径相关基因和转录因子等,进一步探索水稻纹枯病的防御反应机制。本研究获得如下结果:1、立枯丝核菌侵染Osa-miR535-3p转基因植株后,与野生型植株相比,Osa-miR535-3p敲除后植株发病程度加重,而Osa-miR535-3p过表达植株发病程度明显减轻,表现出对立枯丝核菌具有一定的抗性,并且水稻的农艺性状也受到明显的影响:将Osa-miR535-3p敲除后,植株的一次枝梗数目明显增多、穗长有所增加、分蘖数减少、千粒重增加;而将Osa-miR535-3p过表达后,植株株高降低,一次枝梗数目减少、穗长变短、分蘖数增多、千粒重下降,穗部形态发生了明显的改变。2、立枯丝核菌侵染Osa-miR444b.2转基因植株后,发现敲除Osa-miR444b.2后,徐稻3号背景转基因植株发病程度有所减轻,而过表达Osa-miR444b.2后,YSBR1背景的植株发病程度重于野生型,表现为植株对于纹枯病的感病性增强。同样,Osa-miR444b.2也对水稻农艺性状具有一定的影响:将Osa-miR444b.2过表达后,植株表现为株高降低、一次枝梗数目减少、穗长变短、分蘖数减少、千粒重增加。3、初步确定立枯丝核菌侵染Osa-miR535-3p和Osa-miR444b.2转基因植株的表型后,本研究以徐稻3号背景的Osa-miR535-3p、Osa-miR444b.2敲除植株和YSBR1背景的Osa-miR444b.2过表达植株用于后续侵染和构建文库。取R.solani侵染后0 hpi、8 hpi、16hpi的受侵染部位叶鞘构建了 9个转录组测序文库,转录组测序分析结果表明,许多差异表达基因与乙烯信号、生长素信号、脱落酸信号等植物激素信号途径相关,例如 Os01g64790、Os05g41760、Os03g20780、Os04g55520 与乙烯信号途径相关,Os03g18600、Os01g72910、Os02g33820与脱落酸信号途径相关。此外,Os11g3 7970、Os12g36860、Os07g03730、Os12g36850、Os11g37950与病程相关蛋白的表达有关,且表达量在8hpi和16hpi连续上升。同时,分析结果还显示一些转录因子表达量和差异表达基因数目在不同时间点也发生明显变化,WRKY转录因子Os01g43650、Os08g38990、Os11g02530、Os09g25070表达量在8 hpi和16 hpi发生显着上调或下调,而F-box、Myb等转录因子差异表达基因数目也存在较大差异。表明这些转录因子也参与了水稻防御R.solani侵染的过程。Osa-miR535-3p和Osa-miR444b.2参与了水稻应答R.solani侵染的过程,并影响水稻农艺性状。分析发现的一些可能参与水稻应答纹枯病侵染过程的基因如生长素信号、乙烯信号、脱落酸信号等植物激素信号通路相关基因和WRKY、F-box等转录因子,为进一步揭示水稻抗纹枯病的分子机制提供了支持,对于加快抗纹枯病品种的培育和提高水稻产量与品质具有重要意义。
刘浩[2]（2020）在《水稻纹枯病抗性相关基因OsSAM及其功能的初步鉴定》文中认为水稻纹枯病是一种由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）侵染植株引起的水稻病害。水稻对纹枯病的抗性属于典型的数量性状,目前尚未发现免疫或高抗的主基因抗病水稻种质。本课题组前期应用基因芯片技术分析了易感病水稻品种TP309在纹枯病菌侵染12 h后的基因表达谱,筛选出一个抗病候选基因OsSAM,并通过CRISPR/Cas9敲除和基因过表达技术构建了两种突变体水稻,分别命名为CrSAM、OeSAM。本研究包括对获得的突变体材料进行连续三代的阳性筛选并进行相关纹枯病抗性研究,主要研究结果如下:（1）对T1、T2、T3代水稻材料进行阳性筛选。根据过表达突变体OeSAM的质粒序列设计特异性引物进行PCR扩增鉴定阳性;根据基因敲除突变体CrSAM的CRISPR靶点设计特异性引物进行PCR扩增并测序,检测目的片段的碱基变化鉴定阳性。在T3代获得7个OeSAM阳性株系,1个CrSAM阳性纯合株系。（2）在T3代水稻的分蘖末期采用牙签法进行纹枯病菌接种。于接种后7 d调查病斑面积,结果显示野生型病斑面积为0.74 cm2,CrSAM病斑面积为4.01 cm2,OeSAM病斑面积为0.52 cm2,结果呈极显着差异（P<0.01）。于水稻抽穗后30 d调查纹枯病病级,结果显示野生型病级为6.75,CrSAM病级为8.23,OeSAM病级为4.95,结果呈极显着差异。以上表明CrSAM更易感病,OeSAM更抗病,初步证明基因OsSAM与水稻纹枯病抗性呈正相关关系。（3）在T3代水稻成株期进行基本农艺性状调查,在成熟期进行产量测定。结果显示CrSAM的株高、叶绿素含量、剑叶高、剑叶长极显着低于野生型,分蘖数、分蘖夹角极显着高于野生型;OeSAM的株高、分蘖数极显着高于野生型,剑叶高显着高于野生型（P<0.05）。将水稻农艺性状与对应纹枯病病级作相关性分析,发现CrSAM病级与株高的相关系数r为-0.442,表明在CrSAM中株高与纹枯病病级呈负相关关系。测产结果得野生型产量最高,亩产量为523.23 kg,其次为OeSAM 498.65 kg,CrSAM 264.78 kg。CrSAM亩产量仅为野生型的0.51倍,表明CrSAM病害严重导致减产。（4）用RT-PCR和qPCR技术检测基因OsSAM在野生型、CrSAM与OeSAM的倒三叶叶鞘、倒二叶叶鞘、倒三叶、倒二叶四种水稻组织内的表达量。结果显示在CrSAM水稻组织内未检测到该基因表达;在OeSAM四个部位的该基因表达量均显着高于野生型;在水稻叶片内的表达量均显着高于叶鞘。另外在CrSAM、OeSAM和野生型接种纹枯病菌后的0 h、1 h、24 h、72 h分别取样接种分蘖的倒三叶叶鞘、倒三叶、倒二叶叶鞘、倒二叶进行qPCR检测水稻纹枯病病程相关基因OsPR1b、PDR、E2F的表达量变化。结果表明在水稻倒三叶叶鞘和倒二叶叶鞘中,CrSAM中病程基因表达量最高,其次为野生型、OeSAM,病程基因的表达量与水稻纹枯病病级呈正相关关系。
单文峰[3]（2020）在《水稻抗纹枯病QTL元分析及抗病品种YSBR1染色体片段导入系的构建与基因定位》文中提出水稻是世界上最重要的粮食作物之一。由立枯丝核菌引起的纹枯病是水稻三大病害之一,年均发病面积和造成的产量损失均位居水稻各病害之首。培育和推广抗病品种是控制病害发生最经济有效的措施,然而,由于水稻对纹枯病的抗性为典型数量性状且易受环境影响,使得通过传统育种手段难以选育抗病品种。通过分子标记辅助选择抗病QTL被认为是培育抗纹枯病品种的可行途径,但是目前已报道的抗纹枯病QTL间的重演性不高,因此,发掘重演性高的抗纹枯病QTL具有重要的理论价值和实际意义。本文收集了前人公开发表的水稻纹枯病抗性QTL以及容易影响纹枯病抗性的株高、抽穗期等性状QTL信息,进一步采用元分析方法挖掘重演性高且与农艺性状无关的抗纹枯病一致性QTL（MqSB）,在此基础上结合表达谱数据推测分析MqSB区间内的可能候选基因。同时,本研究以高抗纹枯病水稻品种YSBR1为供体,在江苏推广的超级稻品种泰粳394（T394）背景下构建了全基因组染色体片段导入系,并以此初步定位了纹枯病抗性及部分农艺性状基因/QTL。主要结果如下:1.收集了前人发表的有关水稻纹枯病抗性QTL的定位研究论文23篇,整理获得207个纹枯病抗性QTL、109个抽穗期QTL和62个株高QTL。通过元分析,分别获得49个MqSB、28个抽穗期一致性QTL（MqHD）和16个株高一致性QTL（MqPH）。位置比较显示,有37个MqSB区间内不存在MqHD或MqPH。结合6组水稻响应纹枯病菌侵染的转录组数据,发现MqSB区间内的差异表达基因更多与水稻防御物质积累信号及病原菌诱导的感病反应相关信号途径有关。进一步结合公开的基因组织特异性表达数据,对10个置信区间小于100kb的MqSB进行了候选基因分析,筛选出28个候选基因,为下一步候选基因的验证提供了信息基础。2.利用280对亲本间多态性分子标记,对224个高世代YSBR1/T394全基因组染色体片段导入系进行检测、筛选,获得123个导入不同染色体片段的株系,累计覆盖80.5%的YSBR1基因组。对YSBR1、T394及85个导入系进行重测序并与分子标记检测结果相比较,发现有17个株系重测序鉴定的导入片段数与分子标记鉴定的导入片段数一致;其余株系使用两种方法鉴定的导入片段数量差值在1-8个之间,重测序方法比分子标记方法平均多鉴定出1个片段。结合导入系群体的部分农艺性状、纹枯病抗性表型及基因型数据,进行QTL定位,分别检测到与株高、抽穗期、育性、光叶、穗型和纹枯病抗性相关的QTL有5、4、10、4、2和6个;在这其中,有5个QTL区间内存在已克隆的相应性状基因,有3个纹枯病抗性QTL（qSB2、qSB4和qSB11）分别与以上3个MqSB间存在明显区间重叠。3.课题组前期鉴定到两个来自YSBR1的主效抗纹枯病数量性状基因（qSB-2YSBR1和qSB-12YSBR1）,本研究进一步对导入片段与其区间相关的40个导入系（Lemont背景）进行田间与温室纹枯病抗性鉴定,将qSB2 YSBR1定位在第2染色体ZY31.2-RM166之间,物理间距3.2Mb;认为qSB12YSBR1区间内存在2个紧密连锁的抗性基因,分别位于标记ZY25.2-RM235和RM6217-ZY25.1区间内,物理间距分别为0.9Mb和2.5Mb。此外,利用实验前期构建的46个与抗纹枯病数量基因qSB-9TQ位置相关的片段导入系,对qSB-9TQ进行了重复定位,进一步证实qSB-9TQ位于Y84-Y86区间内,该区间完全包含MqSB-9-5和之前报道的qSB-9TQ的精细定位区间。以上结果为进一步克隆水稻纹枯病抗性及重要农艺性状基因/QTL创建了丰富的材料基础,具有重要的理论价值与实际意义。
王嘉楠[4]（2020）在《三个抗纹枯病数量基因和两个抗稻瘟病基因在粳稻中的育种应用研究》文中研究表明纹枯病（Sheath blight）和稻瘟病（Rice blast）是我国水稻生产上发生面积最大、造成损失最严重的两个真菌性病害。在抗病育种实践中,发掘抗病基因、培育抗病品种是最经济有效的策略。结合分子标记技术,对目标抗病基因进行直接选择,将抗病基因导入到优良品种中,可以大大提高选育效率。本课题组前期发现三个主效抗纹枯病数量基因,分别来自籼稻品种特青（TQ）第9染色体、华粳籼74（HJX）第11染色体和YSBR1第12染色体,依次命名为qSB-9TQ、qSB-11HJX和qSB-12YSBR1。Pi40和Pigm是已见报道的抗谱较宽的两个抗稻瘟病基因,但在改良江苏粳稻品种的抗性研究还少有报道。通过分子标记辅助选择,本研究将以上三个抗纹枯病数量基因和两个抗稻瘟病基因导入到不同粳稻品种中,研究其在粳稻纹枯病和稻瘟病抗性改良中的应用价值,为粳稻抗病分子育种提供理论依据和育种中间材料。主要结果如下:1、通过分子标记辅助选择,将qSB-9TQ、qSB-11HJX和qSB-12YSBR1分别导入连粳6号、南粳9108、南粳44、南粳5055、临稻10号、W030以及辽粳选系等7个粳稻品种中,对获得的回交高世代材料进行田间纹枯病抗性鉴定和农艺性状调查。结果显示,同一背景中,携带不同抗性数量基因的株系,其纹枯病病级均显着低于受体亲本,不同基因降低的病级间略有差异,总体以qSB-12YSBR1降低病级最大;各基因在不同粳稻背景中的表现趋势相同。对导入目标数量基因的株系进行农艺性状考察,发现导入目标数量基因对于改良粳稻品种的农艺性状基本没有不利影响。2、通过分子标记辅助选择,将qSB-9TQ和qSB-11HJX聚合到连粳6号和南粳9108两个粳稻背景,对聚合株系进行纹枯病抗性鉴定。结果显示:在连粳6号背景中,qSB-9TQ和qSB-11HJX单独存在时分别可减轻病级0.99和1.04级（0-9级病级评价指标）;而两个基因聚合时可减轻病级1.55级,互作效应为减轻病级0.48级,互作效应未达统计显着水平;两个基因在南粳9108背景中的聚合效果与连粳6号中的趋势相同。对聚合系进行农艺性状调查,发现qSB-9TQ和qSB-11HJX的聚合对农艺性状基本没有不利影响。综上所述,qSB-9To、qSB-11HJX和qSB-12YSBR1在粳稻中具有较大的育种应用价值,同时聚合两个基因有利于进一步提高纹枯病抗性。3、通过分子标记辅助选择,将稻瘟病抗性基因Pi40和Pigm分别导入至武运粳32、盐粳16、华粳8号、泗稻17以及淮粳1309等粳稻品种背景中,用江苏省农科院植保所提供的混合菌株接种。穗颈瘟抗性接种鉴定结果表明:携带Pigm的株系穗颈瘟病级在0-1级,而对应的不带有Pigm的株系（含受体亲本）穗颈瘟病级在7-9级;携带Pi40的株系穗颈瘟病级7-9级,与对应的受体亲本基本一致。在赣榆自然鉴定圃对携带Pigm或Pi40的株系进行自然鉴定,结果显示,携带Pigm株系稻瘟病病穗率显着低于相应的不带有Pigm的株系,携带Pi40的株系稻瘟病病穗率与相应的受体亲本间没有明显差异。将稻瘟病抗性基因Pi40和Pigm分别导入到华粳8号、武运粳32号和盐粳16中,得到HJ8Pg、WYJ32Pg、WYJ32Pi40和YJ16Pi40,利用109个稻瘟病菌株对携带Pigm和Pi40的株系及其受体亲本进行苗期抗谱鉴定,结果显示,携带Pigm的株系对测试菌株的抗谱明显宽于轮回亲本。上述结果表明,Pigm在江苏粳稻抗稻瘟病育种中具有较高的育种应用价值。
刘洋[5]（2020）在《基于遗传学和转录组学筛选水稻抗纹枯病相关基因的研究》文中研究说明水稻（Oryza sativa L.）是主要的粮食作物之一,为世界近半数人口提供口粮。水稻纹枯病是由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani Kühn）引起的真菌性病害,是我国水稻三大病害之一,威胁水稻产量,严重时可造成减产达50%。目前化学防治仍是控制水稻纹枯病的主要方法,因此,筛选抗性持久稳定的水稻品种,研究水稻响应纹枯病菌胁迫的机制,挖掘抗病相关基因是开展水稻抗病育种的前提。本研究基于水稻Ds插入突变群体筛选水稻抗纹枯病相关基因并初步探究高抗品种的抗病机制,并通过转录组分析方法对水稻响应纹枯病菌的差异表达基因进行了筛选和分类分析。主要结果如下:1.用于建立群体的起始水稻品系（Ds-s）中Ds插入在1号染色体中未编码基因的区域,接种纹枯病菌证实,Ds-s纯合品系与野生型对照Dongjin呈现类似的感病症状。利用Ds-s纯合水稻种子并通过组织培养获得300个子代（Regeneration 1）R1杂合体,并自交获得R2纯合群体。通过Southern印迹杂交实验表明300个子代中Ds插入位点具有多态性。2.对300个R2代Ds插入突变系,利用离体叶片法接种R.solani AG1-IA观察突变体的抗病性。其中,0.67%的品种对纹枯病表现出较强的抗性,0.67%的品种对纹枯病易感,7.6%的品系表现出中抗,而91%则与对照组水稻Dongjin（DJ）呈现出类似的感病表型。3.对高抗Ds突变体,利用iPCR方法克隆Ds侧翼序列,测序结果表明在一个高抗突变体中Ds插入在PHYB基因的第二个内含子中。Southern印迹杂交分析表明,在phyB突变体中Ds为单拷贝,揭示其抗性可能是由突变PHYB所致。进一步RT-PCR实验结果表明,phyB为敲除突变体。4.RT-PCR结果表明,乙烯信号通路关键基因（EIL1、EIL2、EIN2和ERF063）、茉莉酸（JA）合成酶基因（LOX2）和水杨酸（SA）信号下游基因PBZ1的表达水平在phyB突变体中与野生型对照相比均明显上调,表明PHYB可能调控植物激素信号相关基因表达。相比野生型对照,EIL1过表达植株更抗病,相反EIL1沉默突变体更感病,表明PHYB可能通过负调控ET信号调节水稻对纹枯病的抗性。5.为进一步筛选抗水稻抗纹枯病相关基因,利用转录组测序方法分析接菌前后的水稻基因的表达差异。转录组测序结果共筛选出6838个差异表达基因（fold change>2倍,p<0.05）,其中3802个基因上调,而3036个基因下调。随机选取了9个差异表达基因进行qPCR验证,发现结果与转录组数据一致。6.通过GO、KEGG和Mapman聚类方法对差异表达的基因进行了归类。GO分析发现,差异基因在结合与催化活性、细胞器及代谢过程显着富集,而30个KEGG包含核糖体、碳代谢与氨基酸生物合成途径。Mapman分析结果表明,植物激素和代谢等途径变化显着。进一步鉴定差异表达基因在水稻抗纹枯病中的作用,转录组测序发现OsWRKY53在接菌后诱导表达,因此对OsWRKY53突变体和过表达植物进行抗病性鉴定。结果证实,相比野生型对照植物OsWRKY53过表达感病而突变体抗病,证明OsWRKY53负调控水稻对纹枯病的抗性。此外,启动子序列分析显示,大量差异表达基因的启动子区含有响应R.solani的基序。本研究通过遗传学和转录组学方法筛选出水稻抗纹枯病相关基因,并为今后研究水稻抗性机制提供了理论基础。
许赵蒙[6]（2020）在《水稻纹枯病抗性相关基因OsSBR1的功能鉴定和组学分析》文中进行了进一步梳理水稻纹枯病是水稻重要病害之一。水稻纹枯病抗性受多基因位点控制,为数量性状遗传,迄今尚未发现高抗或免疫的抗病水稻种质。研究水稻纹枯病抗性分子机制对培育抗病水稻品种和防治纹枯病具有重要意义。本实验室对水稻纹枯病抗性相关基因OsSBR1的前期研究结果表明,OsSBR1的RNAi抑制表达水稻株系对纹枯病表现抗病、过表达水稻株系表现感病。为了深入研究OsSBR1的生物学功能及相关抗病调控机理,本研究围绕OsSBR1转基因纯合株系的筛选及纹枯病抗性鉴定,OsSBR1编码蛋白的亚细胞定位,OsSBR1-RNAi株系和基因编辑纯合突变株系的转录组分析,以及OsSBR1-RN Ai株系中激素含量变化和差异代谢物进行研究。研究结果如下:（1）对OsSBR1过表达水稻株系和基因编辑纯合突变株系进行离体叶片接种鉴定,根据病斑面积大小,OsSBR1过表达株系表现纹枯病感病,基因编辑株系表现抗病,验证了Os SBR1负调控纹枯病抗性的研究结果。将OsSBR1-GFP融合蛋白表达载体和与RFP融合的内质网蛋白表达载体共转化水稻原生质体,GFP和RFP荧光信号完全重叠,从而将OsSBR1蛋白定位于水稻细胞内质网。（2）在接种纹枯菌的OsSBR1-RNAi抗病株系和感病品种TJ394的水稻组织中检测到纹枯菌转录物。通过比较转录组分析,从抗感水稻接种纹枯菌24 hpi和48 hpi的水稻组织,分别鉴定出165个和536个纹枯菌差异表达基因（differentially expressed gene,DEGs）。从OsSBR1敲除株系（抗病基因型）和感病品种徐稻3号纹枯菌侵染24 hpi的水稻组织中鉴定出266个纹枯菌差异基因。根据纹枯菌基因功能注释信息,其中多个差异基因与纹枯菌致病功能相关。抗感水稻使纹枯菌基因呈差异表达,间接验证了OsSBR1负调控纹枯病抗性的结果。（3）在纹枯菌接种24 hpi对OsSBR1突变株系及感病品种徐稻3号进行比较转录组分析。抗感基因型在空白接种和纹枯菌接种下分别有851个和2341个差异基因,其中WRKY、MYB等83个转录因子基因在纹枯菌接种后呈差异表达。GO和KEGG富集分析显示,抗感基因型的DEGs在光合作用、氧化还原过程、信号转导途径、代谢途径、次级代谢生物合成等多个通路有显着富集。茉莉酸信号途径相关基因、乙烯生物合成途径相关基因以及乙烯转录因子发生差异表达,表明Os SBR1可能调控茉莉酸信号转导途径和乙烯信号转导途径。（4）在纹枯菌接种24 h时间点对OsSBR1-RNAi抗病株系及感病品种TJ394进行比较转录组分析,结合前期研究关于以上抗感水稻材料48 hpi时间点的转录组数据,对抗感水稻在不同接种时间点的转录组变化进行综合分析。差异基因GO分类富集分析结果显示,在接种和不接种条件下DEGs在氧化还原过程、光合作用及离子结合等多个条目上均有显着富集,表明OsSBR1-RNAi株系存在抗病相关基因“预存性表达”。与感病品种泰粳394相比,OsSBR1-RNAi株系在纹枯菌侵染后茉莉酸生物合成相关基因呈显着下调,乙烯转录因子及乙烯生物合成相关基因呈差异表达,表明OsSBR1可能调控茉莉酸信号转导途径和乙烯信号转导途径。（5）取OsSBR1-RNAi抗病株系和感病对照品种泰粳394接种纹枯菌12 h、24 h、48 h后的水稻组织,检测茉莉酸（JA）及其衍生物JA-ILe、水杨酸（SA）含量。抗感基因型空白接种样品的激素含量无显着差异。与空白接种比较,抗感基因型纹枯菌接种样品的JA和JA-ILe含量均被诱导,呈相似变化趋势。OsSBR1-RNAi株系的12 hpi样品的JA和JA-ILe激素含量稍高于泰粳394的含量;在24 hpi和48 hpi,泰粳394的JA和JA-ILe激素含量显着高于OsSBR1-RNAi株系。SA含量的检测结果与JA基本相反,两者相互拮抗。纹枯菌接种48 h后,OsSBR1-RNAi抗病株系和感病对照品种的代谢组分析显示,SA在OsSBR1-RNAi抗病株系中显着上调,暗示OsSBR1-RNAi株系的纹枯病抗性可能是通过JA对SA含量的拮抗作用来实现的。本研究为解析水稻纹枯病抗性分子机理、水稻与纹枯菌分子互作机制建立了研究基础,创制的水稻基因编辑抗纹枯病株系为水稻育种提供了优良种质资源。
杜丹[7]（2020）在《水稻CC-NB-LRR抗病基因OsRLR1的图位克隆与功能分析》文中提出水稻（Oryza sativa L.）不仅是研究单子叶生物重要的模式植物,也是世界上重要的粮食作物之一。而水稻在种植过程中会受到环境中许多生物胁迫,特别是一些病虫害可以导致水稻严重减产、影响品质。同时,大量农药的使用严重污染了环境,提高了病虫的耐药性,造成了粮食安全的隐患。因而,水稻抗病机制的基础研究对阐释植物的抗性机理具有重大的理论意义,在水稻抗病育种中也具有巨大的应用价值。稻瘟病（Pyricularia oryzae）和白叶枯病（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）均是水稻的主要病害,严重时可导致水稻颗粒无收。因此,稻瘟病和白叶枯病抗病机制研究有助于阐释水稻的抗性机理和抗性育种。本研究利用EMS（ethyl methane sulfonate）诱变籼稻恢复系缙恢10号（J10）获得稳定遗传的叶片类病变突变体并进行了系列研究。通过遗传分析和图位克隆技术得到了目的基因,RPM1 like gene 1（OsRLR1）,进一步分析了该抗病基因的表达模式,解析了野生型和突变体OsRLR1的蛋白结构以及在水稻抗病机制中的功能,主要研究结果如下:1.OsRLR1基因的定位与克隆在自然种植条件下,突变体rlr1从苗期开始在叶片中出现类似病变的细胞死亡现象并伴随着叶片衰老黄化的表型,而病变和黄化表型受到光的诱导。在突变体中,抗病相关基因OsNPR1、OsWRKY45、PAL1、OsPR1a、OsPR10被激活,对稻瘟病和白叶枯病的抗性显着增强。遗传分析表明,突变体rlr1的表型受一对隐性核基因的控制。利用分子标记将目的基因OsRLR1定位在第10染色体66 kb的区间内。通过gDNA和cDNA的测序发现,只有基因LOCOs10g07978编码框的第953位碱基由A颠换为T,导致编码氨基酸由GLU变为了VAL。因而,初步将LOCOs10g07978作为候选的目的基因。2.OsRLR1基因功能互补分析为了验证LOCOs10g07978是否是目的基因,克隆了其在野生型中的编码框序列,并在突变体rlr1中过量表达,突变体rlr1细胞死亡、早衰以及植株农艺性状得到了恢复。同时,与突变体rlr1相比,转基因互补植株的抗病性也得到了削弱,接近野生型的水平。因此,LOCOs10g07978是目的基因OsRLR1。3.OsRLR1基因的蛋白结构分析OsRLR1编码一个CC-NBS-LRR（CNL）抗病蛋白,多重序列比对与系统进化树分析表明OsRLR1编码蛋白与其他CNL蛋白很好的聚类在一起,与拟南芥抗病蛋白AtRPM1和玉米ZmRPM1同源,并与水稻的一个稻瘟病抗性蛋白OsPid3高度一致。对OsRLR1蛋白序列分析表明突变位点位于NB结构域,临近一个相对保守的RNBS-B/Se模体。参照蛋白ZAR1的三维建模表明:在OsRLR1（E318V）中,突变导致了其三维空间结构与结合ATP时的活化状态极为相似,暗示突变可能会导致结合的ATP不能水解或影响ADP结合而持续处于活化状态。同时,OsRLR1蛋白在酵母中能够通过CC结构域形成聚合体。OsRLR1和OsRLR1（E318V）蛋白均定位于细胞核。OsRLR1是一个典型的CNL抗病蛋白。4.OsRLR1基因的表达分析在水稻生长发育的苗期、分蘖期和抽穗期,对各个组织定量分析表明:基因OsRLR1主要在叶片中表达。OsRLR1的启动子表达GUS基因染色表明:GUS蛋白主要在叶片维管束中表达。在突变体中,OsRLR1基因的表达水平与叶片过敏反应程度正相关。稻瘟病和白叶枯病接种后,OsRLR1基因的表达上调。因此,OsRLR1在叶片维管束中组成性表达,但也受阳光和病菌的诱导。5.OsRLR1基因的过表达功能分析在野生型J10中,利用Ubiquitin强启动子过量表达OsRLR1基因。与野生型相比,转基因纯合植株对稻瘟病菌和白叶枯病菌的抗病性显着增强,抗病相关基因OsNPR1、OsPR1a和OsPR10的表达量也上升,但其抗病性仍然没有达到突变体rlr1的水平。不过,过量表达OsRLR1植株中没有出现类似病变的表型,同时对株高、结实率等农艺性状也没有影响,因而该基因在育种上具有潜在的应用价值。6.OsRLR1的互作蛋白筛选与验证通过酵母双杂交（Y2H）系统,利用OsRLR1的CC端结构域,筛选到了OsRLR1的互作转录因子OsWRKY19。并利用OsRLR1和OsRLR1（E318V）的CC-NB、CC-NB-ARC和全长蛋白序列在酵母中对互作关系进行了验证,进一步利用双分子荧光互补实验（BiFC）对OsWRKY19与OsRLR1的相互作用在植物体内进行验证分析。在烟草叶片细胞中,OsRLR1和OsRLR1（E318V）均能与OsWRKY19在细胞核中发生相互作用而发出黄色荧光信号,并与核指示剂DAPI指示信号高度吻合。因此,OsRLR1和OsRLR1（E318V）均能与OsWRKY19在细胞核中发生蛋白质的相互作用。7.互作蛋白OsWRKY19的干涉分析在突变体rlr1中,利用干涉技术（RNAi）沉默基因OsWRKY19的表达,获得了纯合的T2代干涉植株,OsWRKY19的表达量在不同的转基因株系中均得到了不同程度的降低,与突变体rlr1相比,干涉植株黄化和过敏反应的类病变表型得到了很大程度的减轻,植株长势和相关农艺性状也得到了很大程度的恢复。干涉植株接种稻瘟病菌和白叶枯病菌后,OsNPR1、OsPR1a和OsPR10的表达量也得到了很大程度的降低,对稻瘟病和白叶枯病的抗病性减弱。因此推测OsWRKY19正向调控了OsRLR1介导的抗性反应。8.转录因子OsWRKY19的转录分析在水稻原生质体中瞬时表达融合蛋白OsWRKY19-GAL,并测量LUC的活性发现OsWRKY19具有转录激活活性。进一步瞬时共表达OsWRKY19和OsPR10的1000bp的启动子发现OsWRKY19能够激活OsPR10的表达。而在烟草中,瞬时共表达实验表明OsRLR1和OsRLR1（E318V）均对OsWRKY19的转录具有增强作用,且OsRLR1（E318V）的增强效果远高于OsRLR1。
徐琴琴[8]（2020）在《异源PGIP蛋白抗水稻纹枯病分析及毒素降解菌筛选》文中认为立枯丝核菌（Rhizoctonia solani Kühn）属丝核菌属（Rhizoctonia）,根据菌丝融合情况被划分为14个融合群（anastomosis groups,AGs）,即AG-1到AG-13和AG-BI,大多数类群为植物病原真菌,研究表明其主要致病因子为细胞壁降解酶和毒素。立枯丝核菌具有寄主范围广、危害大特性,每年因立枯丝核菌侵染所引起的水稻纹枯病造成水稻减产严重。目前,水稻种质资源中尚未发现对纹枯病完全免疫的抗性材料,也没有检测到稳定的主效数量性状基因座（quantitative trait locus,QTL）,而且缺乏好的新的抗性基因资源。因此,本研究主要从两方面着手进行研究:对多个具有潜在抗真菌病害的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（polygalacturonase inhibiting protein,PGIP）基因进行克隆及分析,并通过转基因技术转化获得抗纹枯病水稻;对立枯丝核菌主要致病因子毒素进行提纯、活性分析及活性成分鉴定,并筛选了毒素降解菌和候选毒素降解酶。主要结果如下:1.分别从大豆、番茄和甜瓜等植物中克隆到8个不同PGIP基因:CucmPGIP1、TriPGIP、GlyPGIP1、GlyPGIP2、CurPGIP、CapPGIP、BraPGIP和SolPGIP。通过生物信息学分析,除CapPGIP在N端未形成一个疏水性信号肽,8个PGIP均符合PGIP蛋白家族衡量标准:含主要功能结构LRR重复;存在保守半胱氨酸残基,且半胱氨酸残基主要位于N和C端;存在潜在N-糖基化位点;在N端形成一个疏水性信号肽,且信号肽剪切位点均在丝氨酸后。2.8个PGIP基因分别构建载体及转化DH5α,获得含有重组质粒的DH5α阳性菌株。通过基因枪介导法获得转SolPGIP基因阳性转基因水稻。转基因水稻在温室抗纹枯病鉴定中表现出较强的抗性。3.采用HPLC、LC-MS/MS和生物活性测定等方法对立枯丝核菌毒素进行提纯、活性分析及活性成分鉴定,结果表明毒素活性成分中共含70种物质,为糖类、糖醇、羧酸和羧酸酯（盐）。测定粗毒素生物活性发现,当浓度为20 mg/mL时,烟草叶片明显坏死;当浓度达100 mg/mL时,水稻胚根几乎无法生长;毒素会改变植物细胞膜透性从而造成电解质外渗;25 mg/mL毒素显着诱导水稻防御酶活性提高,但随着处理时间延长,各酶活降低。4.筛选出了3株能以毒素为唯一碳源的菌株（A-6、D-5和E-8）,分别属于泛菌属（Pantoea）、肠杆菌属（Enterobacter）和节杆菌属（Arthrobacter）。分析各菌株对立枯丝核菌的抑菌效果,其中立枯丝核菌靠近A-6、D-5菌株一端的菌丝出现明显断横,且菌核形成的时间更晚和数量更少。菌株D-5胞外蛋白降解毒素能力最好。进行蛋白全谱分析,菌株A-6蛋白液成分复杂,故对D-5和E-8蛋白全谱分析结果进行UniProt检索,发现D-5蛋白液中含4种重要水解酶:Carb1、Pept、Carb2和Poly,E-8蛋白液中含3种糖苷水解酶。
何子文[9]（2019）在《利用CRISPR/Cas9技术编辑Pi21和D3基因改良水稻抗性和株型的研究》文中提出我国作为人口大国,确保粮食产量稳定是关系国计民生的重要问题。针对有限的土地资源,培育多抗、高产、优质的品种是确保粮食安全的根本途径。杂交育种等传统方法由于具有分子机理不清、针对性较差及选育周期较长等问题,已经逐渐难以适应日益提高的育种目标,而CRISPR/Cas9技术通过编辑植物内源基因来改良抗性、提高产量,具有高效、精准的特点。YH208（宜恢208,籼稻）具有产量高、米质好等优点,但易感稻瘟病,而携带隐性抗性的Pi21等位基因对10株稻瘟病生理小种具有抗性。DS（粳稻）具有耐寒、米质优等特点,但其株高过高、易倒伏、分蘖少,而据报道D3基因负调控分蘖和株高。为此,我们利用CRISPR/Cas9技术对YH208的Pi21和DS的D3基因进行编辑以期改良其抗性或株型;同时为进一步探究Pi21、D3的作用机制以及水稻遗传改良提供材料基础。结果如下:1、利用CRISPR/Cas9编辑Pi21基因改良YH208的抗性,前期我们筛选到一份高感穗颈瘟的恢复系YH208（宜恢208）,将其与Pi21感病等位基因进行比对分析,发现在其238-247、454-468处有1bp的置换（C替换成T）以及9bp、15bp的缺失,与已报道的感病基因型都不同,因此我们推测其可能为一个新的感病等位基因。在其Pi21的第二个外显子上设计双靶位点,通过遗传转化及筛选获得了10株阳性植株,将其分为3种突变类型:1种纯合突变,2种杂合双等位突变。进一步从T1代中筛选获得20株不含转基因成分的pi21突变体;2、通过田间观察发现,pi21突变体苗期植株表现矮小,营养生长发育迟缓,从两叶一心时期从下部老叶边缘开始出现类病斑,但到花期类病斑表型则完全消失。经台盼蓝、DAB染色试验,结果表明pi21突变体叶片出现大量的过氧化氢累积及细胞死亡。进一步通过qRT-PCR检测发现,突变体的防御相关基因PR1a、PR10b及SA、JA、ETH通路相关基因WRKY45、LOX2、EIN2上调表达,表明pi21突变体中的防御反应和SA、JA、ETH表达显着增强;3、将YH208离体划伤接种46份单孢菌株,筛选到7个亲和菌株。从中选择TJ13、DZ108对温室和田间环境中培养的pi21突变体进行稻瘟病抗性接种,结果表明产生类病斑的pi21突变体增强了对稻瘟病的抗性,同时我们也对产生类病斑的pi21突变体分别进行白叶枯和纹枯病抗性鉴定,结果表明pi21突变体易感纹枯病,但不影响对白叶枯的抗性;4、通过对pi21突变体主要农艺性状的统计分析,表明pi21突变体相比野生型其米质、分蘖数和每穗实粒数不受影响,但株高、结实率受到一定影响,尤其产量上明显低于野生型;5、利用CRISPR/Cas9编辑D3基因改良DS的株型,首先将DS（粳稻）与日本晴中负调控分蘖的D3基因进行序列比对,发现序列完全一样,表明DS中的D3基因同样负调控分蘖。在DS的D3基因外显子前端设计单个靶位点进行基因编辑,从T1代中共获得了4种类型的纯合突变体,均为碱基缺失,其中d3KO#1仅缺失3bp,没有产生移码突变。进一步从T2代中筛选到51株不含转基因成分d3突变体;6、田间叶龄统计发现,d3突变体生育期相比野生型缩短1周。通过连续两代的考察发现T1代纯合株系的农艺性状能够稳定遗传到子代,除d3KO#1株系农艺性状相比野生型没有明显差异外,其他3个株系株高变矮、分蘖增多,但穗长变短、每穗实粒数变少,导致最终产量没有差异;7、对d3突变体接种稻瘟菌、白叶枯菌和纹枯菌,结果表明d3突变体相比野生型增强了对白叶枯的抗性,但易感纹枯病和稻瘟病。与野生型相比,d3突变体在接种稻瘟菌后其防御相关基因表达显着下调,稻瘟菌侵入位点过氧化氢累积减少;以上结果表明:利用CRISPR/Cas9技术编辑YH208的Pi21和DS的D3基因,pi21突变体产生类病斑并增强了对稻瘟病的抗性,d3突变体表现出分蘖数增多、株高降低使株型得到改良,并增强了对白叶枯病的抗性。此外,获得了20（pi21）和51（d3）株不含转基因成分的突变体,为进一步探究Pi21、D3的作用机制以及水稻遗传改良提供了宝贵资源。
张金锋[10]（2018）在《水稻响应纹枯病菌AG1 IA侵染比较转录组分析及抗性相关基因鉴定》文中研究表明近年来,水稻纹枯病在我国已经成为仅次于稻瘟病的重要病害,鉴于水稻抗病过程的复杂性以及抗性指标鉴定的多样性,传统方法解析水稻纹枯病抗性机制遭受很大制约并且进展缓慢。伴随着转录组技术的发展,其在大数据挖掘以及机制分析等相关方面所展示出的优势被广泛的应用于科学研究中。本研究以中抗品种特青和高感品种莱蒙特为材料,运用RNA-seq技术对两个品种不同侵染时间点进行转录组测序,通过比较不同时间点抗感转录差异以探讨水稻抗纹枯病的相关分子机制。同时基于比较转录组差异基因分析、共表达网络构建及抗病特异性模块挖掘筛选鉴定抗病相关基因,通过对基因功能的分析研究以期进一步解析水稻抗纹枯病的相关机制,亦为水稻抗纹枯病种质创制奠定相应基础。相关研究结果如下:1.为了探讨水稻抗纹枯病可能的分子机制,选取中抗材料特青和高感材料莱蒙特叶片接菌纹枯病菌AG1 IA,基于预试验的结果选择纹枯病菌AG1 IA侵染后的12、24、36、48和72 h取样,利用RNA-seq技术对5个侵染时期进行转录组测序。比较转录组分析结果表明伴随着纹枯病菌侵染时间的延长,相关的差异基因表达逐渐增加,莱蒙特不同时间点差异表达基因数目高于同时期特青中的基因数目,表明莱蒙特面临更大的侵染压力相对于特青。24 h和48 h是病原菌侵染的两个重要时期,这两个时期的差异基因表达数目远高于其他三个时期。对于前期（12 h）来说特青相关抗性基因和抗性代谢的富集要早于莱蒙特并且抗性富集条目比莱蒙特更丰富。综合两个品种的转录结果,我们共筛选到4802个差异表达基因并进行相关聚类比较分析。最后基于5个侵染时期的GO和KEGG富集比较,我们认为光合作用、光呼吸、苯丙氨酸类代谢以及茉莉酸途径在水稻抗纹枯病过程中起着至关重要的作用。通过比较转录组分析我们初步解析了水稻抵御纹枯病菌侵染的相关分子机制,为后期开展水稻抗纹枯病相关基因挖掘和功能研究奠定基础。2.基于前期的比较转录组分析,我们设定Transcripts per million>10作为筛选阈值,经过滤筛选在特青和莱蒙特中获得11947个差异共表达基因。利用加权共表达网络分析（WGCNA）,对上述11947个差异基因进行模块化分析和共表达网络构建,以期搜寻同抗性相关的表达模块和关联基因。通过基因模块和共表达网络的比较分析,我们获得一些同抗性高度相关的基因模块,如特青早期的黄色模块和后期的黑色模块以及莱蒙特早期的绿松色模块和后期的棕色模块。基于核心基因分析筛选到一些同纹枯病抗性高度关联的基因,如VQ类蛋白基因和JAZ类基因。本研究中我们通过共表达网络比较分析进一步解析水稻纹枯病抗性相关机制,同时结合基因的功能注释及代谢分析为今后深入研究基因的功能以及其所参与的生物学过程等提供数据支撑。3.基于前期的比较转录组和共表达模块分析筛选到一个在特青中表现出高的转录表达而在莱蒙特中几乎没有转录表达的基因,定量检测结果同转录组结果一致并据此推测该基因有可能参与水稻纹枯病相关抗性过程。经BLAST比对以及文献查阅,该基因为水稻胞质类激酶OsRLCK5,亚细胞定位结果显示OsRLCK5分布于细胞质和细胞膜。酵母双杂交和双分子荧光互补试验结果显示OsRLCK5能够同OsGRX20和OsRBCS2分别互作。特青中OsRLCK5干涉表达以及莱蒙特中过表达结果显示特青中OsRLCK5干涉表达降低了水稻对纹枯病的抗性同时田间自然发病观察发现干涉株系发病程度要明显大于对照特青,而OsRLCK5在莱蒙特中的过表达增强了水稻对纹枯病的抗性。接菌后抗性相关基因定量检测结果显示莱蒙特中过表达OsRLCK5能够增加PR1、PR10和PAL的表达同时能够引起茉莉酸合成关键基因OsAOS2和OsAOC表达上调而特青中OsRLCK5干涉降低了上述基因的表达。NBT和DAB染色进行活性氧检测结果显示OsRLCK5能够影响活性氧的积累,对活性氧相关清除酶活性检测显示OsRLCK5参与调节活性氧清除酶的活性进而能够调节活性氧的动态平衡。综合上述结果,我们认为OsRLCK5能够通过调节抗性相关基因表达以及活性氧水平进而调节水稻纹枯病抗性。4.基于Transcripts per million值,比较转录组分析发现OsBURP16在中抗品种特青中24 h至72 h转录表达量显着高于莱蒙特。本研究通过在特青中OsBURP16的干涉表达以及莱蒙特中的过表达以试图探究OsBURP16对水稻纹枯病抗性的可能影响。转基因结果显示OsBURP16干涉降低了特青对纹枯病菌AG1 IA的抗性而过表达增强了莱蒙特对纹枯病的抗性。有别于以往的研究结果,亚细胞定位显示OsBURP16在细胞核中亦有分布。通过酵母双杂交筛选到一系列同OsBURP16互作基因,互作基因分析显示绝大部分基因参与水稻的相关抗逆过程,基于酵母双杂交结果我们认为OsBURP16广泛的参与植物体相关生物学过程并可能进一步影响水稻纹枯病抗性。对抗性相关基因定量检测结果显示PR10和PAL两个基因在过表达莱蒙特株系中的表达显着高于对照莱蒙特。综合上述结果我们认为OsBURP16有可能通过同相关调节植物抗逆基因互作以及参与调节抗性相关基因的表达进而影响水稻对纹枯病的抗性。
二、转基因水稻株系的纹枯病抗性分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、转基因水稻株系的纹枯病抗性分析（论文提纲范文）
（1）水稻miR535-3p和miR444b.2在抗纹枯病过程中的功能与分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 水稻纹枯病的危害症状及研究进展 |
| 1.1 水稻纹枯病的病原菌及症状 |
| 1.2 水稻纹枯病菌侵染过程 |
| 1.3 水稻纹枯病的防治 |
| 1.4 水稻对纹枯病抗性研究进展 |
| 2 miRNA研究进展 |
| 2.1 植物miRNA的产生及作用机制 |
| 2.2 miRNA的功能 |
| 2.3 miRNA在水稻应对病原物侵染过程中的功能 |
| 3 本研究的目的及意义 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 植物材料和生长条件 |
| 1.2 病原菌培养和侵染材料准备 |
| 1.3 质粒载体 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 水稻纹枯病菌接种方法 |
| 2.2 核酸物质提取 |
| 2.3 质粒提取与PCR产物纯化 |
| 2.4 cDNA合成与qRT-PCR检测 |
| 2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化 |
| 2.6 农杆菌GV3101感受态细胞的制备与转化 |
| 2.7 miRNA靶基因预测及初步验证 |
| 2.8 农杆菌介导的烟草共表达 |
| 2.9 miRNA与靶基因互作验证 |
| 2.10 转录组分析 |
| 结果与分析 |
| 1 不同水稻品种对纹枯病的抗性 |
| 2 miRNA敲除/过表达转基因材料鉴定 |
| 3 miRNA转基因材料在R.solani侵染后表型鉴定与农艺性状分析 |
| 3.1 Osa-miR535-3p增强水稻对纹枯病的抗病性 |
| 3.2 Osa-miR535-3p影响水稻的农艺性状 |
| 3.3 Osa-miR444b.2增强水稻对纹枯病的感病性 |
| 3.4 Osa-miR444b.2影响水稻的农艺性状 |
| 4 水稻响应R.solani侵染的基因表达分析 |
| 4.1 转录组文库的构建 |
| 4.2 转录组数据数据整体分析 |
| 4.3 miR535_KO差异表达基因及其功能分析 |
| 4.4 miR444_KO差异表达基因功能分析 |
| 4.5 miR444_OE差异表达基因功能分析 |
| 4.6 差异表达基因KEGG通路分析 |
| 5 靶基因敲除转基因材料的鉴定 |
| 讨论 |
| 1 Osa-miR535-3p抗水稻纹枯病的功能和对农艺性状的影响 |
| 1.1 Osa-miR535-3p在水稻抗纹枯病中的功能 |
| 1.2 Osa-miR535-3p对水稻农艺性状的影响 |
| 2 Osa-miR444b.2抗水稻纹枯病的功能和对农艺性状的影响 |
| 2.1 Osa-miR444b.2在水稻抗纹枯病中的功能 |
| 2.2 Osa-miR444b.2对水稻农艺性状的影响 |
| 3 miRNA抗病机制初探 |
| 全文总结 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录一: 本论文所使用引物 |
| 附录二: 本论文所用试剂、抗生素、培养基及其配制方法 |
| 附录三: 主要仪器设备 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（2）水稻纹枯病抗性相关基因OsSAM及其功能的初步鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 综述 |
| 1.1 水稻纹枯病的产生和危害 |
| 1.2 立枯丝核菌致病机理的研究进展 |
| 1.3 水稻纹枯病的防治措施 |
| 1.3.1 药剂防治 |
| 1.3.2 生物防治 |
| 1.4 水稻纹枯病抗性遗传育种研究进展 |
| 1.5 转基因育种技术 |
| 1.5.1 基因过表达技术 |
| 1.5.2 基因编辑技术 |
| 1.6 研究背景和意义 |
| 1.7 研究路线 |
| 2 水稻OsSAM基因突变体的构建和鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 水稻材料 |
| 2.1.2 质粒及菌株 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 载体构建与农杆菌转化 |
| 2.1.6 水稻叶片DNA提取 |
| 2.1.7 引物设计 |
| 2.1.8 PCR反应 |
| 2.1.9 基因测序 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 过表达阳性株系的鉴定 |
| 2.2.2 基因敲除阳性株系的鉴定 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 3 水稻纹枯病接种与鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 水稻材料 |
| 3.1.2 纹枯病菌 |
| 3.1.3 培养基 |
| 3.1.4 水稻育苗与大田种植 |
| 3.1.5 纹枯病菌培养 |
| 3.1.6 纹枯病菌接种 |
| 3.1.7 纹枯病病级评定 |
| 3.1.8 其他农艺性状调查 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 水稻纹枯病病情分析 |
| 3.2.2 其他农艺性状分析 |
| 3.2.3 产量分析 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 4 水稻纹枯病抗性相关基因的检测 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 纹枯病接种和取样 |
| 4.1.4 水稻组织RNA提取 |
| 4.1.5 cDNA合成 |
| 4.1.6 引物设计 |
| 4.1.7 qPCR检测 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 RNA质量检测 |
| 4.2.2 OsSAM基因表达量分析 |
| 4.2.3 病程相关基因表达量分析 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间的成果 |
| 致谢 |
（3）水稻抗纹枯病QTL元分析及抗病品种YSBR1染色体片段导入系的构建与基因定位（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 水稻纹枯病 |
| 1.1.1 水稻纹枯病的发生与危害 |
| 1.1.2 水稻纹枯病抗性鉴定方法与评价体系 |
| 1.1.3 水稻抗纹枯病种质资源挖掘 |
| 1.2 水稻数量性状基因(QTL)定位概述 |
| 1.2.1 水稻QTL定位原理和方法 |
| 1.2.2 QTL的精细定位与克隆 |
| 1.3 水稻纹枯病抗性研究进展 |
| 1.3.1 水稻纹枯病抗性QTL定位 |
| 1.3.2 关联分析挖掘纹枯病抗性位点 |
| 1.3.3 水稻响应纹枯病菌的转录组分析 |
| 1.4 元分析原理及应用 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 QTL元分析材料与方法 |
| 2.1.1 水稻纹枯病抗性QTL定位文献及QTL相关信息整理 |
| 2.1.2 元分析流程 |
| 2.1.3 一致性QTL区间内候选基因分析方法 |
| 2.2 染色体片段导入系构建材料与流程 |
| 2.3 染色体导入片段的鉴定与长度估算 |
| 2.3.1 DNA的提取 |
| 2.3.2 多态性分子标记的筛选、开发与检测 |
| 2.3.3 全基因组测序鉴定导入片段 |
| 2.4 田间农艺性状调查及抗性鉴定方法 |
| 2.5 QTL定位及分析方法 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 水稻抗纹枯病抗性QTL元分析 |
| 3.1.1 水稻纹枯病抗性QTL的原始信息分析 |
| 3.1.2 一致性图谱构建 |
| 3.1.3 水稻纹枯病抗性及相关性状QTL元分析 |
| 3.1.4 MqSB区间内的纹枯病菌诱导差异表达基因分析 |
| 3.1.5 置信区间小于100kb的MqSB候选基因分析 |
| 3.2 YSBR1染色体片段导入系的构建及部分性状QTL定位 |
| 3.2.1 亲本间多态性分子标记开发 |
| 3.2.2 染色体片段导入系群体评价 |
| 3.2.3 全基因组测序鉴定导入片段 |
| 3.2.4 导入系群体农艺性状描述性统计与相关性分析 |
| 3.2.5 导入系群体中部分农艺性状QTL定位 |
| 3.2.6 导入系群体中纹枯病抗性QTL定位 |
| 3.3 主效抗纹枯病数量基因qSB-2~(YSBR1)和qSB-12~(YSBR1)定位 |
| 3.4 主效抗纹枯病数量基因qSB-9~(TQ)的重复定位 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 水稻抗纹枯病QTL元分析的可行性与重要性 |
| 4.2 一致性抗纹枯病QTL (MqSB)的应用价值 |
| 4.3 染色体片段导入系亲本选择及优缺点 |
| 4.4 与前人定位的水稻抗纹枯病QTL比较 |
| 参考文献 |
| 附录1. 公开发表的水稻抗纹枯病QTL定位文献信息汇总 |
| 附录2. 抗纹枯病QTL以及株高、抽穗期QTL |
| 附录3. 一致性遗传图谱引物表 |
| 附录4. 原始QTL映射在参考物理图谱上 |
| 附录5. 抗纹枯病QTL热点区域信息汇总 |
| 附录6. 一致性株高和抽穗期QTL信息汇总 |
| 附录7. 10个MqSB区间内基因的组织特异性表达数据 |
| 附录8 表达谱实验信息汇总 |
| 附录9. 表达谱实验差异表达基因汇总(电子文档) |
| 附录10. 11对多态性Indel标记信息 |
| 附录11. YSBR1/T394全基因组染色体片段导入系多态性引物表 |
| 附录12-1. 田间抗性鉴定多重比较 |
| 附录12-2. 温室抗性鉴定多重比较 |
| 附录13. MQSB区间内的病程相关基因 |
| 攻读硕士学位期间科研成果 |
| 致谢 |
（4）三个抗纹枯病数量基因和两个抗稻瘟病基因在粳稻中的育种应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 水稻纹枯病发生危害 |
| 1.1.1 水稻纹枯病的发生及分布 |
| 1.1.2 水稻纹枯病的症状及危害 |
| 1.1.3 水稻纹枯病的防治方法 |
| 1.2 水稻纹枯病抗性遗传育种研究进展 |
| 1.2.1 水稻纹枯病抗性鉴定体系 |
| 1.2.2 抗病资源发掘与利用 |
| 1.2.3 水稻抗纹枯病QTL定位研究 |
| 1.2.4 水稻抗纹枯病QTL的育种利用 |
| 1.3 水稻稻瘟病发生危害 |
| 1.3.1 稻瘟病的发生及危害概况 |
| 1.3.2 稻瘟病菌致病机理 |
| 1.4 稻瘟病抗性遗传育种研究进展 |
| 1.4.1 稻瘟病抗性鉴定技术 |
| 1.4.2 抗性基因定位及克隆研究 |
| 1.4.3 水稻抗稻瘟病育种 |
| 1.4.3.1 常规育种 |
| 1.4.3.2 分子标记辅助选择育种 |
| 1.5 本研究目的与意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 纹枯病相关试验材料 |
| 2.1.2 稻瘟病相关试验材料 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 总体研究思路 |
| 2.2.2 DNA提取 |
| 2.2.3 分子标记检测 |
| 2.2.4 纹枯病抗性鉴定 |
| 2.2.5 穗颈瘟抗性鉴定 |
| 2.2.6 稻瘟病大田自然鉴定 |
| 2.2.7 苗瘟抗性鉴定 |
| 2.2.8 农艺性状考察 |
| 2.2.9 试验统计方法 |
| 第3章 结果分析 |
| 3.1 抗纹枯病数量基因在不同粳稻背景中的抗性效应 |
| 3.1.1 各基因双侧分子标记的选择效果分析 |
| 3.1.2 qSB-9~(TQ)在不同粳稻背景中的抗性效应 |
| 3.1.3 qSB-11~(HJX)在不同粳稻背景中的抗性效应 |
| 3.1.4 qSB-12~(YSB1)在不同粳稻背景中的抗性效应 |
| 3.2 携带不同抗纹枯病数量基因的回交株系农艺性状分析 |
| 3.3 qSB-9~(TQ)和qSB-11~(HJX)聚合分析 |
| 3.3.1 聚合系的纹枯病抗性分析 |
| 3.3.2 聚合系的农艺性状分析 |
| 3.4 抗稻瘟病基因Pi40初Pigm在粳稻中的应用研究 |
| 3.4.1 携带Pi40和Pigm的回交株系接种鉴定 |
| 3.4.2 携带Pi40或Pigm的回交株系的稻瘟病自然鉴定 |
| 3.4.3 携带Pi40或Pigm的株系苗期抗稻瘟病人工接种鉴定 |
| 第4章 小结与讨论 |
| 4.1 三个抗纹枯病数量基因在粳稻抗病性改良中的应用价值分析 |
| 4.2 聚合抗纹枯病数量基因进一步提高水稻纹枯病的抗性是可行的 |
| 4.3 Pi40和Pigm在改良粳稻稻瘟病抗性中的育种价值分析 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（5）基于遗传学和转录组学筛选水稻抗纹枯病相关基因的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 水稻纹枯病及抗病相关基因研究进展 |
| 1.1 水稻纹枯病研究概况 |
| 1.1.1 水稻纹枯病侵染方式及致病机制 |
| 1.1.2 水稻对纹枯病的抗性机制 |
| 1.1.3 水稻纹枯病抗病育种研究 |
| 1.2 Ac/Ds转座系统及研究进展 |
| 1.3 光敏色素与植物激素在抗病中的研究进展 |
| 1.3.1 光敏色素研究概况 |
| 1.3.2 植物激素在抗病中的作用研究进展 |
| 1.4 转录组测序技术及研究进展 |
| 1.5 本文研究目的及意义 |
| 第二章 水稻Ds插入突变群体建立及对纹枯病的抗性鉴定 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验仪器 |
| 2.1.2 试验试剂 |
| 2.1.3 供试培养基 |
| 2.1.4 供试植株 |
| 2.1.5 供试菌株 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 水稻Ds插入突变体库的建立 |
| 2.2.2 DNA提取 |
| 2.2.3 Southern印迹杂交 |
| 2.2.4 水稻离体叶片接种纹枯病菌 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 Ds起始突变体株系表现出与野生型植株相似症状 |
| 2.3.2 Ds在染色体上的跳跃活性 |
| 2.3.3 水稻Ds插入突变体抗病性鉴定 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 水稻抗纹枯病相关基因PHYB及其抗病机制探究 |
| 3.1 供试材料 |
| 3.1.1 试验仪器 |
| 3.1.2 试验试剂 |
| 3.1.3 供试植株 |
| 3.1.4 供试菌株 |
| 3.1.5 供试载体与菌株 |
| 3.1.6 供试培养基 |
| 3.1.7 引物 |
| 3.1.8 其他 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 RNA提取 |
| 3.2.2 去除基因组DNA及酚氯仿抽提 |
| 3.2.3 cDNA的合成 |
| 3.2.4 Ds侧翼序列克隆 |
| 3.2.5 RT-PCR |
| 3.2.6 突变体抗病性鉴定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 phyB突变体基因结构 |
| 3.3.2 phyB突变体提高水稻对纹枯病的抗性 |
| 3.3.3 PHYB调控植物激素介导水稻对纹枯病的抗性 |
| 3.3.4 EIL1正调控水稻对纹枯病的抗性 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 基于转录组结果筛选水稻抗纹枯病相关基因 |
| 4.1 供试材料 |
| 4.1.1 试验仪器 |
| 4.1.2 试验试剂 |
| 4.1.3 供试植物与菌株 |
| 4.1.4 引物 |
| 4.1.5 其他 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 转录组测序样品采集 |
| 4.2.2 RNA提取及反转录 |
| 4.2.3 RNA-seq测序样品处理 |
| 4.2.4 qRT-PCR |
| 4.2.5 cDNA文库构建及转录组数据分析 |
| 4.2.6 突变体抗病性鉴定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 转录组测序样品准备 |
| 4.3.2 响应纹枯病菌的水稻基因表达差异分析 |
| 4.3.3 GO与KEGG归类 |
| 4.3.4 Mapman分析 |
| 4.3.5 OsWRKY53负调控水稻对纹枯病的抗性 |
| 4.3.6 差异表达基因启动子中筛选响应水稻纹枯病菌的cis-elements序列分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 结论与讨论 |
| 5.1 水稻Ds插入突变群体建立及对纹枯病的抗性鉴定 |
| 5.2 水稻抗纹枯病相关基因PHYB及其抗病机制初探 |
| 5.3 基于转录组数据筛选抗纹枯病相关基因 |
| 5.4 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文 |
（6）水稻纹枯病抗性相关基因OsSBR1的功能鉴定和组学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 水稻纹枯病 |
| 1.1.1 水稻纹枯病的发病症状 |
| 1.1.2 水稻纹枯病菌侵染水稻的途径 |
| 1.1.3 水稻纹枯病的防治 |
| 1.1.3.1 纹枯病的非生物防治 |
| 1.1.3.2 纹枯病的生物防治 |
| 1.1.4 水稻纹枯病抗性品种的筛选与培育 |
| 1.2 植物免疫机制 |
| 1.2.1 植物的天然屏障 |
| 1.2.2 植物先天免疫机制 |
| 1.2.2.1 PTI免疫途径 |
| 1.2.2.2 ETI免疫途径 |
| 1.2.2.3 PTI与 ETI共享下游调控网络 |
| 1.3 植物激素在抗病反应中的作用 |
| 1.3.1 茉莉酸参与植物抗病反应 |
| 1.3.1.1 茉莉酸生物合成途径 |
| 1.3.1.2 茉莉酸信号转导途径 |
| 1.3.1.3 茉莉酸在纹枯病抗性中的作用 |
| 1.3.2 乙烯参与植物抗病反应 |
| 1.3.2.1 乙烯生物合成途径 |
| 1.3.2.2 乙烯信号转导途径 |
| 1.3.2.3 乙烯在纹枯病抗性中的作用 |
| 1.3.3 植物激素的调控网络在植物抗病中的作用 |
| 1.4 组学在解析植物抗病调控通路中的作用 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 1.5.1 本研究室前期工作 |
| 1.5.2 本研究的目的与意义 |
| 第2章 水稻纹枯病抗性相关基因OsSBR1的功能鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料、试剂及仪器 |
| 2.2.1 水稻材料 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 OsSBR1 的转基因DNA载体 |
| 2.3.2 OsSBR1的转基因纯合株系鉴定 |
| 2.3.2.1 OsSBR1过表达材料的遗传分析和纯合性鉴定 |
| 2.3.2.2 OsSBR1基因编辑株系的纯合鉴定 |
| 2.3.3 水稻离体叶片纹枯病接种 |
| 2.3.3.1 水稻育苗与纹枯菌培养 |
| 2.3.3.2 水稻纹枯病离体叶片接种 |
| 2.3.3.3 水稻纹枯病离体叶片接种后病斑面积的测量 |
| 2.3.4 水稻RNA提取及q RT-PCR鉴定 |
| 2.3.4.1 水稻RNA提取 |
| 2.3.4.2 实时荧光定量RT-PCR鉴定 |
| 2.3.5 OsSBR1编码蛋白的亚细胞精确定位 |
| 2.3.5.1 水稻原生质体制备 |
| 2.3.5.2 水稻原生质体转化及镜检 |
| 2.3.6 OsSBR1基因编辑株系的粒长、粒宽和千粒重检测 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 OsSBR1过表达株系对纹枯菌表现感病 |
| 2.4.2 OsSBR1基因编辑株系纯合鉴定 |
| 2.4.3 OsSBR1基因编辑株系表现纹枯病抗性 |
| 2.4.4 OsSBR1基因编辑株系粒长、粒宽和千粒重的统计分析 |
| 2.4.5 OsSBR1编码蛋白的亚细胞精确定位 |
| 2.5 小结 |
| 2.6 讨论 |
| 第3章 水稻OsSBR1基因编辑株系的转录组分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料、试剂及仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 转录组测序样品的准备 |
| 3.3.2 转录组数据分析 |
| 3.3.2.1 cDNA合成和测序 |
| 3.3.2.2 生物信息学分析 |
| 3.3.3 差异表达基因的q RT-PCR验证 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 样本间关联性分析 |
| 3.4.2 差异表达基因分析 |
| 3.4.3 差异基因的GO分析 |
| 3.4.4 差异基因的KEGG分析 |
| 3.4.5 OsSBR1可能调控植物激素信号转导途径 |
| 3.4.6 抗感基因型差异基因的q RT-PCR验证 |
| 3.4.7 OsSBR1敲除株系接种样品中纹枯菌转录物检测和转录组分析 |
| 3.5 小结 |
| 3.6 讨论 |
| 第4章 水稻OsSBR1-RNAi株系的转录组分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料、试剂及仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 转录组测序样品的准备 |
| 4.3.2 转录组数据分析 |
| 4.3.2.1 cDNA合成和测序原始数据处理 |
| 4.3.2.2 生物信息学分析 |
| 4.3.3 差异表达基因的q RT-PCR验证 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 抗感基因型中水稻差异基因的筛选 |
| 4.4.2 水稻差异表达基因的GO富集分析 |
| 4.4.3 水稻差异表达基因的KEGG富集分析 |
| 4.4.4 OsSBR1介导的纹枯病抗性与次生代谢物相关 |
| 4.4.5 OsSBR1可能调控植物激素信号转导途径 |
| 4.4.6 抗感基因型差异基因的q RT-PCR验证 |
| 4.4.7 OsSBR1-RNAi株系接种样品中纹枯菌转录物检测和转录组分析 |
| 4.5 小结 |
| 4.6 讨论 |
| 第5章 水稻OsSBR1-RNAi株系的植物激素含量检测 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料、试剂及仪器 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.2.3 实验仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 植物激素检测组织样品的准备 |
| 5.3.2 植物激素检测样品的预处理 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 茉莉酸类物质含量检测分析 |
| 5.4.2 水杨酸含量检测分析 |
| 5.5 小结 |
| 5.6 讨论 |
| 第6章 水稻OsSBR1-RNAi株系的代谢组分析 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 实验试剂 |
| 6.2.3 实验仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 植物组织样品的准备 |
| 6.3.2 生物信息学分析 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.4.1 抗感基因型之间差异代谢物分析 |
| 6.4.2 抗感基因型之间差异代谢物的KEGG富集分析 |
| 6.5 小结 |
| 6.6 讨论 |
| 第7章 结论与展望 |
| 7.1 本研究的主要结论 |
| 7.2 本研究的创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（7）水稻CC-NB-LRR抗病基因OsRLR1的图位克隆与功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物体的防御反应机制 |
| 1.1.1 基础免疫 |
| 1.1.2 特异性免疫反应 |
| 1.1.3 WRKY转录因子概述 |
| 1.1.4 植物激素介导的抗病反应 |
| 1.1.5 系统获得性免疫反应SAR |
| 1.1.6 小RNAs在抗病反应中的作用 |
| 1.2 水稻抗病机制研究 |
| 1.2.1 抗病基因介导稻瘟病抗病机制研究 |
| 1.2.2 R基因介导白叶枯病研究进展 |
| 第二章 OSRLR1的克隆与功能分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与试剂 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 菌株与载体 |
| 2.2.3 主要培养基配方 |
| 2.2.4 主要生化试剂的配方 |
| 2.2.5 主要生化、分子生物学试剂与仪器 |
| 2.3 方法与步骤 |
| 2.3.1 农艺性状调查 |
| 2.3.2 光和色素的测定 |
| 2.3.3 衰老相关指标的测定 |
| 2.3.4 组织化学分析 |
| 2.3.5 图位克隆 |
| 2.3.6 质粒的提取 |
| 2.3.7 候选基因的克隆 |
| 2.3.8 载体的设计与构建 |
| 2.3.9 基因RT-PCR表达分析 |
| 2.3.10 生物信息学分析 |
| 2.3.11 水稻原生质体瞬时表达 |
| 2.3.12 烟草叶片瞬时表达体系 |
| 2.3.13 酵母双杂交实验 |
| 2.3.14 双分子荧光互补实验 |
| 2.3.15 稻瘟病的培养与接种 |
| 2.3.16 白叶枯病的培养与接种 |
| 2.3.17 纹枯病接种实验 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 rlr1的表型与组织化学分析 |
| 2.4.2 突变体rlr1中病程相关基因表达情况 |
| 2.4.3 OsRLR1候选基因的遗传图谱分析 |
| 2.4.4 OsRLR1基因功能互补验证 |
| 2.4.5 OsRLR1的生物信息学分析 |
| 2.4.6 OsRLR1基因的表达分析 |
| 2.4.7 OsRLR1 的亚细胞定位 |
| 2.4.8 OsRLR1的过表达分析 |
| 2.4.9 OsRLR1与OsWRKY19 相互作用 |
| 2.4.10 OsWRKY19 正调控OsRLR1 介导的抗病反应 |
| 2.4.11 OsWRKY19 调控OsPR10 的表达 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 Rlr1是抗性反应自激活类病变突变体 |
| 2.5.2 OsRLR1 是一个典型的CLR抗病基因 |
| 2.5.3 OsRLR1 E318V自激活机制 |
| 2.5.4 OsRLR1正调控水稻抗性反应 |
| 2.5.5 OsRLR1与OsWRKY19 互作调控OsPR10 的表达 |
| 2.6 结论 |
| 1、OsRLR1 是一个典型的CC-NB-LRR抗病蛋白 |
| 2、E318V是一个新的自激活位点 |
| 3、OsWRKY19与OsRLR1 在细胞核中互作并正调控抗性反应 |
| 4、OsWRKY19 调控OsPR10 的表达 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 发表与待发表的论文 |
（8）异源PGIP蛋白抗水稻纹枯病分析及毒素降解菌筛选（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase inhibiting protein,PGIP)研究进展 |
| 1.1 PGIP的结构 |
| 1.2 PGIP的作用机制 |
| 1.3 PGIP在植物抗病中应用 |
| 2 立枯丝核菌毒素研究进展 |
| 2.1 立枯丝核菌毒素提取工艺的发展 |
| 2.2 立枯丝核菌毒素的成分鉴定 |
| 2.2.1 羧酸及衍生物 |
| 2.2.2 糖类及糖胺 |
| 2.3 立枯丝核菌毒素的生物活性检测 |
| 2.3.1 粗毒素混合物生物活性检测 |
| 2.3.2 单一代谢物生物活性检测 |
| 2.4 立枯丝核菌毒素的致病机理 |
| 2.4.1 毒素对细胞破坏作用 |
| 2.4.2 毒素对细胞膜的损伤作用 |
| 2.4.3 毒素对寄主植物酶的影响 |
| 3 本研究的目的和意义 |
| 第二章 不同植物PGIP基因克隆及序列测定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 植物材料 |
| 1.1.2 菌株和载体 |
| 1.1.3 生化及分子生物学试剂 |
| 1.1.4 主要实验仪器 |
| 1.1.5 试剂及培养基的配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 RNA提取 |
| 1.2.2 cDNA合成 |
| 1.2.3 PCR反应 |
| 1.2.4 割胶回收 |
| 1.2.5 连T载体 |
| 1.2.6 转大肠杆菌 |
| 1.2.7 挑单克隆验证及测序 |
| 1.2.8 生物信息学分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PGIP基因的克隆与序列分析 |
| 2.2 PGIPs生物信息学分析 |
| 3 结论与讨论 |
| 第三章 转PGIP基因水稻获得及对纹枯病抗性评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 植物材料 |
| 1.1.2 菌株和载体 |
| 1.1.3 生化及分子生物学试剂 |
| 1.1.4 主要实验仪器 |
| 1.1.5 试剂及培养基的配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 PCR反应 |
| 1.2.2 PGIP载体构建 |
| 1.2.3 大肠杆菌感受态制备及转化 |
| 1.2.4 阳性克隆鉴定 |
| 1.2.5 质粒提取 |
| 1.2.6 基因枪转化水稻 |
| 1.2.6.1 水稻成熟胚愈伤组织的诱导 |
| 1.2.6.2 金粉悬浮液制备 |
| 1.2.6.3 基因枪轰击愈伤组织 |
| 1.2.6.4 抗性愈伤组织的筛选及分化 |
| 1.2.6.5 无菌苗的生根及移栽 |
| 1.2.7 转基因植株PCR鉴定 |
| 1.2.7.1 转基因植株DNA提取 |
| 1.2.7.2 转基因植株的PCR鉴定 |
| 1.2.8 转基因水稻抗纹枯病鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 目的基因获得 |
| 2.2 阳性克隆鉴定 |
| 2.3 转基因水稻的获得与验证 |
| 2.4 转基因水稻抗水稻纹枯病鉴定 |
| 3 结论与讨论 |
| 第四章 立枯丝核菌毒素提纯、活性分析及活性成分鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 植物材料 |
| 1.1.2 供试菌株 |
| 1.1.3 培养基与试剂 |
| 1.1.4 PCR引物与测序 |
| 1.1.5 供试仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 立枯丝核菌培养与纯化 |
| 1.2.2 立枯丝核菌毒素的制备 |
| 1.2.3 立枯丝核菌毒素组分分离与活性分析 |
| 1.2.3.1 TLC定性分析 |
| 1.2.3.2 毒素活性敏感度分析 |
| 1.2.3.3 HPLC组分分离与活性分析 |
| 1.2.3.4 活性组分LC-MS/MS分析 |
| 1.2.4 毒素生物活性及稳定性分析 |
| 1.2.4.1 毒素生物活性分析 |
| 1.2.4.2 毒素稳定性分析 |
| 1.2.5 毒素对不同植株叶片细胞膜损伤的测定 |
| 1.2.6 毒素对不同植株叶片叶绿素含量影响的测定 |
| 1.2.7 毒素对水稻根系活力的影响 |
| 1.2.8 毒素对水稻防御酶的影响 |
| 1.2.8.1 毒素对水稻PAL的影响 |
| 1.2.8.2 毒素对水稻PPO的影响 |
| 1.2.8.3 毒素对水稻POD的影响 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 毒素的制备 |
| 2.2 立枯丝核菌毒素的组分分析 |
| 2.2.1 TLC定性分析 |
| 2.2.2 毒素活性敏感度分析 |
| 2.2.3 HPLC分离活性组分 |
| 2.2.4 活性组分LC-MS/MS分析 |
| 2.3 胚根伸长抑制法测定毒素活性及稳定性 |
| 2.3.1 毒素对水稻胚根伸长的抑制作用 |
| 2.3.2 温度、化合物和酶对毒素活性影响 |
| 2.4 毒素对不同植株细胞膜的损伤 |
| 2.5 毒素对不同植株叶绿素含量的影响 |
| 2.6 毒素对水稻根系活力的影响 |
| 2.7 毒素对水稻防御酶的影响 |
| 3 结论与讨论 |
| 第五章 降解毒素微生物的筛选及胞外蛋白分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 植物材料 |
| 1.1.2 供试菌株和载体 |
| 1.1.3 培养基与试剂 |
| 1.1.4 引物与测序 |
| 1.1.5 供试仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 毒素降解菌的筛选鉴定 |
| 1.2.2 降解菌的抑菌活性 |
| 1.2.3 胞外蛋白获取及生物活性分析 |
| 1.2.4 胞外蛋白再分离及HPLC分析 |
| 1.2.5 SDS-PAGE和蛋白质全谱分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 降解菌筛选鉴定 |
| 2.2 降解菌的抑菌效果 |
| 2.3 降解菌胞外蛋白获取及生物活性分析 |
| 2.4 降解菌胞外蛋白液再分离及HPLC分析 |
| 2.5 SDS-PAGE和蛋白质全谱分析 |
| 3 结论与讨论 |
| 第六章 总结与展望 |
| 1 全文总结 |
| 1.1 不同植物PGIP基因克隆和序列分析 |
| 1.2 转PGIP基因水稻获得及对纹枯病抗性评价 |
| 1.3 立枯丝核菌毒素的分析 |
| 1.4 毒素降解微生物筛选及蛋白酶分析 |
| 2 问题与展望 |
| 参考文献 |
（9）利用CRISPR/Cas9技术编辑Pi21和D3基因改良水稻抗性和株型的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 作物育种现状 |
| 1.2 基因编辑 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas9 |
| 1.2.2 CRISPR/Cpf1 |
| 1.2.3 单碱基编辑 |
| 1.2.4 基因组编辑应用于农作物遗传改良 |
| 1.3 植物免疫机制研究进展 |
| 1.3.1 水稻的主要病害 |
| 1.3.2 植物先天免疫反应 |
| 1.3.3 类病斑研究进展 |
| 1.4 植物株型研究进展 |
| 1.4.1 独脚金内酯调控株型的机制 |
| 1.4.2 植物株型育种 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 水稻材料 |
| 2.1.2 实验中用到的菌株材料 |
| 2.1.3 实验中用到的质粒及菌株 |
| 2.1.4 常用的分子生物学酶和试剂 |
| 2.1.5 常用抗生素与培养基 |
| 2.1.6 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 CDS序列的比对分析 |
| 2.2.2 靶位点的选择及脱靶分析 |
| 2.2.3 CRISPR/Cas9 靶位点载体构建 |
| 2.2.4 潮霉素抗性鉴定 |
| 2.2.5 转基因植株DNA的提取 |
| 2.2.6 无转基因成分PCR鉴定 |
| 2.2.7 水稻叶片DAB染色 |
| 2.2.8 水稻叶片台盼蓝染色 |
| 2.2.9 突变体抗性鉴定 |
| 2.2.10 农艺性状的考察 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 利用CRISPR/Cas9 技术编辑Pi21 基因改良宜恢208 抗性的研究 |
| 3.1.1 宜恢208中Pi21 等位基因序列分析 |
| 3.1.2 敲除Pi21 基因靶位点的设计及脱靶分析 |
| 3.1.3 pi21 突变体突变类型分析 |
| 3.1.4 无转基因成分的pi21 突变体筛选 |
| 3.1.5 pi21 突变体产生类病斑并增强防御反应 |
| 3.1.6 pi21 突变体抗病性鉴定 |
| 3.1.7 pi21 突变体农艺性状的考察分析 |
| 3.2 利用CRISPR/Cas9 技术编辑D3 基因改良DS株型的研究 |
| 3.2.1 DS中 D3 等位基因序列分析 |
| 3.2.2 敲除D3 基因靶位点的设计及脱靶分析 |
| 3.2.3 d3 突变体突变类型分析 |
| 3.2.4 无转基因成分的d3 突变体筛选 |
| 3.2.5 d3 突变体农艺性状的考察 |
| 3.2.6 d3 突变体抗病性鉴定 |
| 第四章 结论与讨论 |
| 4.1 pi21 突变体诱导类病斑的产生,并增强对稻瘟病的抗性 |
| 4.2 pi21 突变体对白叶枯病、纹枯病抗性以及农艺性状的影响 |
| 4.3 d3 突变体分蘖增加、株高变矮,同时增强了对白叶枯的抗性 |
| 4.4 SL在水稻抗性中的作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 实验所用引物 |
| 附录2 突变体农艺性状考察统计 |
| 作者简历 |
（10）水稻响应纹枯病菌AG1 IA侵染比较转录组分析及抗性相关基因鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 水稻纹枯病 |
| 1.1.1 纹枯病菌分类、生活史和病害流行 |
| 1.1.2 纹枯病菌侵染过程 |
| 1.1.3 纹枯病菌致病机制 |
| 1.1.4 水稻纹枯病鉴定 |
| 1.2 植物抗病机制 |
| 1.2.1 植物PTI免疫反应 |
| 1.2.2 植物ETI免疫反应 |
| 1.3 基于RNA-seq的植物抗病转录组学研究 |
| 1.4 立体依据和研究意义 |
| 第二章 基于RNA-Seq技术的纹枯病菌AG1 IA侵染水稻叶片比较转录组分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.1.3 菌丝侵染染色及观察 |
| 2.1.4 总RNA提取、cDNA文库构建及Illumina测序 |
| 2.1.5 转录组数据与参考基因组序列比对 |
| 2.1.6 转录本组装、合并与比较分析 |
| 2.1.7 转录本定量分析 |
| 2.1.8 转录本数据探索分析 |
| 2.1.9 时间序列表达模式挖掘 |
| 2.1.10 SOM网络的基因表达数据聚类 |
| 2.1.11 功能富集分析 |
| 2.1.12 荧光定量PCR验证 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 关于材料的选择和取样时间点的确定 |
| 2.2.2 转录组样本的测序结果统计 |
| 2.2.3 转录组数据注释 |
| 2.2.4 水稻转录组数据的聚类分析和基因表达情况的Real-time PCR检测 |
| 2.2.5 特青和莱蒙特各接种时间点差异基因分析 |
| 2.2.6 特青和莱蒙特上调差异基因的GO富集分析 |
| 2.2.7 特青和莱蒙特差异表达基因KEGG富集分析 |
| 2.2.8 苯丙氨酸类代谢 |
| 2.2.9 茉莉酸代谢 |
| 2.2.10 基于自组织映射网络的基因聚类 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 光合作用 |
| 2.3.2 光呼吸 |
| 2.3.3 抗性次生代谢产物 |
| 2.3.4 植物-病原物互作 |
| 2.3.5 茉莉酸信号途径 |
| 第三章 基于WGCNA的水稻纹枯病抗感基因模块识别及共表达网络构建分析 |
| 3.1 试验材料与方法 |
| 3.1.1 数据收集及处理 |
| 3.1.2 基因共表达网络构建与基因模块划分 |
| 3.1.3 基因共表达模块与表型和外界作用的关联 |
| 3.1.4 基于核心基因的基因共表达网络构建 |
| 3.1.5 模块内基因功能注释 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 样品聚类 |
| 3.2.2 基因共表达网络的构建 |
| 3.2.3 特青特异性模块查找及分析 |
| 3.2.4 莱蒙特特异性模块查找及分析 |
| 3.2.5 特青和莱蒙特枢纽基因表达网络比较 |
| 3.2.6 全局核心基因分析及抗性核心基因分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 水稻胞质激酶OsRL CK5调节水稻的纹枯病抗性 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 序列分析 |
| 4.2.2 水稻叶片总DNA提取(CTAB法) |
| 4.2.3 总RNA提取 |
| 4.2.4 质粒小量提取方法 |
| 4.2.5 OsRL CK5 PCR扩增和载体构建 |
| 4.2.6 亚细胞定位 |
| 4.2.7 酵母双杂交技术 |
| 4.2.8 酵母质粒提取 |
| 4.2.9 双分子荧光互补技术 |
| 4.2.10 cDNA合成和qRT-PCR |
| 4.2.11 农杆菌转化及注射本生烟 |
| 4.2.12 病原菌接菌及鉴定 |
| 4.2.13 叶绿素含量测定 |
| 4.2.14 抗性相关基因测定 |
| 4.2.15 活性氧检测 |
| 4.2.16 相关防御酶测定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 OsRL CK5基因表达分析 |
| 4.3.2 OsRL CK5基因编码蛋白质生物信息学分析 |
| 4.3.3 OsRL CK5蛋白质的保守结构域及同源性 |
| 4.3.4 OsRL CK5基因亚细胞定位 |
| 4.3.5 酵母双杂交和BiFC验证 |
| 4.3.6 OsRL CK5干涉降低了特青对纹枯病的抗性 |
| 4.3.7 OsRL CK5过表达增强了莱蒙特对纹枯病的抗性 |
| 4.3.8 接菌后叶绿素含量变化 |
| 4.3.9 活性氧及相关防御酶基因表达 |
| 4.3.10 抗性相关基因 |
| 4.3.11 茉莉酸合成相关基因 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 OsBURP16对水稻纹枯病抗性的研究 |
| 5.1 试验材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料及生长条件 |
| 5.1.2 DNA提取 |
| 5.1.3 叶片总RNA提取 |
| 5.1.4 质粒提取 |
| 5.1.5 载体构建和水稻遗传转化 |
| 5.1.6 亚细胞定位 |
| 5.1.7 酵母双杂交及酵母质粒提取 |
| 5.1.8 qRT-PCR |
| 5.1.9 农杆菌转化及注射本生烟 |
| 5.1.10 病原菌接菌 |
| 5.1.11 抗性相关基因检测 |
| 5.1.12 数据分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 接菌后OsBURP16基因表达特点 |
| 5.2.2 OsBURP16亚细胞定位 |
| 5.2.3 酵母双杂交 |
| 5.2.4 干涉降低了特青对纹枯病菌AG1 IA抗性 |
| 5.2.5 过表达增强了莱蒙特对纹枯病菌AG1 IA抗性 |
| 5.2.6 抗性相关基因测定 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 研究存在的不足 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 附录3 |
| 附录4 |
| 附录5 |
| 附录6 |
| 附录7 |
| 攻读博士学位期间学术成果完成情况 |
| 致谢 |
四、转基因水稻株系的纹枯病抗性分析（论文参考文献）
- [1]水稻miR535-3p和miR444b.2在抗纹枯病过程中的功能与分子机制[D]. 张朝阳. 扬州大学, 2021(08)
- [2]水稻纹枯病抗性相关基因OsSAM及其功能的初步鉴定[D]. 刘浩. 淮阴工学院, 2020(02)
- [3]水稻抗纹枯病QTL元分析及抗病品种YSBR1染色体片段导入系的构建与基因定位[D]. 单文峰. 扬州大学, 2020
- [4]三个抗纹枯病数量基因和两个抗稻瘟病基因在粳稻中的育种应用研究[D]. 王嘉楠. 扬州大学, 2020
- [5]基于遗传学和转录组学筛选水稻抗纹枯病相关基因的研究[D]. 刘洋. 沈阳农业大学, 2020(08)
- [6]水稻纹枯病抗性相关基因OsSBR1的功能鉴定和组学分析[D]. 许赵蒙. 浙江师范大学, 2020(01)
- [7]水稻CC-NB-LRR抗病基因OsRLR1的图位克隆与功能分析[D]. 杜丹. 西南大学, 2020
- [8]异源PGIP蛋白抗水稻纹枯病分析及毒素降解菌筛选[D]. 徐琴琴. 浙江大学, 2020(01)
- [9]利用CRISPR/Cas9技术编辑Pi21和D3基因改良水稻抗性和株型的研究[D]. 何子文. 四川农业大学, 2019(01)
- [10]水稻响应纹枯病菌AG1 IA侵染比较转录组分析及抗性相关基因鉴定[D]. 张金锋. 四川农业大学, 2018(11)