一、GUS基因分泌型植物表达载体的构建及对烟草的转化（论文文献综述）
刘维妙[1]（2021）在《芸薹属基本种扩展蛋白基因家族的进化分析及花粉发育相关扩展蛋白基因的功能分化研究》文中认为花粉发育和授粉受精过程是开花植物完成有性生殖的重要环节。花粉发育异常会影响其功能的正常完成,进而影响后代的繁衍。授粉受精过程的顺利进行离不开花粉管正常的萌发和伸长。花粉管的萌发通常起始于成熟花粉粒的内壁。在花粉管快速伸长的过程中尤其需要细胞壁的快速扩展,众多细胞壁合成和重塑蛋白都参与其中。植物扩展蛋白（expansins,EXP）是一类重要的细胞壁重塑蛋白,可以与细胞壁的多糖组分结合,通过破坏细胞壁组分之间的非共价键引起植物细胞壁的松弛,促进植物细胞的生长。扩展蛋白基因家族被细分为四个亚家族,分别是EXPA（expansin A subfamily,扩展蛋白A亚家族）、EXPB（expansin B subfamily,扩展蛋白B亚家族）、EXLA（expansin like A subfamily,扩展蛋白类A亚家族）和EXLB（expansin like B subfamily,扩展蛋白类B亚家族）。虽然近年来扩展蛋白基因的功能被广泛研究,但是有关扩展蛋白基因在植物生殖发育阶段的功能以及有关EXPA和EXPB亚家族基因协调作用都还鲜有报道。本文以白菜‘矮脚黄’（Brassica campestris ssp.chinensis,syn.B.rapa ssp.chinensis cv.Aijiaohuang）核雄性不育两用系ajhGMS‘Bcajh97-01A/B’和黑芥（B.nigra cv.Z1411-02）以及甘蓝（B.oleracea cv.Jingfeng 1）为材料,对芸薹属三个二倍体基本种的扩展蛋白基因家族进行鉴定、进化和表达分析,明确三个基本种扩展蛋白基因家族的进化特征,为探究扩展蛋白基因在花粉和花粉管发育过程中的功能提供相关基础;由基因家族分析筛选到两个在白菜花粉发育后期和花粉管中高表达的基因BrEXPB4和BrEXPB9,通过人工microRNA技术研究BrEXPB4和BrEXPB9在白菜花粉和花粉管发育中的功能;采用CRISPR/Cas9技术和过表达技术对两者在模式植物拟南芥中的同源基因AtEXPB5进行生物学功能的分析,并对与其在花粉和花粉管发育阶段具有冗余功能的AtEXPA4进行验证;通过酵母单杂交和双荧光素酶实验对AtEXPB5和BrEXPB4/9可能参与的转录调控路径进行研究。取得的主要结果与结论如下:（1）通过三步分析法,鉴定了芸薹属三个基本种（白菜、甘蓝和黑芥）的扩展蛋白基因家族,并经与模式植物拟南芥的系统发育、基因结构和理化特性的比较分析对它们的扩张模式和进化细节进行了研究,发现经过独立的进化,扩展蛋白基因家族在这三个基本种中的相似性较多,而分歧较少。通过比较启动子和编码序列的差异,发现在拟南芥和三个基本种的直系同源物之间存在显着正相关性。随后的表达分析表明这三个物种的扩展蛋白基因家族中存在广泛的功能差异,特别是在生殖发育过程中筛选到两个在白菜花粉和花粉管发育阶段强烈表达的基因BrEXPB4和BrEXPB9。（2）通过烟草和洋葱瞬时表达体系进行亚细胞定位的结果表明,BrEXPB4和BrEXPB9都定位在细胞壁上,这与它们都具有信号肽结构的预测结果一致。通过荧光定量PCR和GUS基因报告系统进行的时空表达分析表明,BrEXPB4和BrEXPB9的表达模式也很相似,都是从单核花粉后期开始表达,并随着花粉的发育,表达量逐步升高,并且可以一直持续到花粉管中。（3）采用人工microRNA技术分别和同时抑制BrEXPB4和BrEXPB9的表达,进而对它们的生物学功能进行鉴定。当它们被单独抑制时,对植株的生长发育并没有造成明显的影响。然而当它们的表达被同时抑制时,却造成约50%的花粉败育,并不能正常萌发。对败育花粉的细致观察显示,花粉的败育起始于单核花粉晚期,进一步使小孢子细胞质和花粉内壁降解,最终造成花粉败育和萌发异常。（4）通过亚细胞定位和时空表达分析,发现AtEXPB5定位在细胞壁上,并且其编码基因在成熟花粉粒和花粉管中强烈表达。然而,无论是敲除AtEXPB5还是过表达AtEXPB5都未对拟南芥的生长发育造成显着影响。结合前人相关电子表达谱的研究,发现仅有AtEXPA4在生殖发育阶段与AtEXPB5具有相似的表达模式。构建了AtEXPA4的敲除和过表达材料,并通过杂交获得AtEXPA4和AtEXPB5的双突变体,观察发现在双突变体中,花粉管伸长的速度显着减缓,并且无论是AtEXPB5还是AtEXPA4都可以恢复双突变体花粉管伸长减缓的表型,说明AtEXPA4和AtEXPB5冗余地参与了花粉管的发育。（5）通过亚细胞定位和时空表达分析,发现AtEXPA4定位在细胞壁上,其编码基因不仅在生殖发育阶段表达,也在拟南芥的根中优势表达。主根长度和根分生区的测量结果表明,AtEXPA4对于主根的生长具有促进作用。（6）通过酵母单杂交和双荧光素酶实验表明,AtEXPB5的表达可由AtTDF1和AtAMS共同激活,而这一调控途径在白菜中并不保守。这说明AtEXPB5和BrEXPB4/9的生物学功能产生分化,并且参与不同的转录调控路径。BrEXPB4/9及其同源基因AtEXPB5在表达模式、功能和调控网络上显示出巨大差异说明在进化过程中,同源基因物也会产生功能和调控的变化。
陈妤[2]（2021）在《马尾松GPPS基因及其启动子功能分析》文中进行了进一步梳理马尾松是我国大宗商品材及良好的纤维工业原料,生长快,材质优,也是主要的采脂树种,其以萜类化合物为主要成分且有特定气味的松脂可提取松节油和松香,它们都是重要的化工原料,松脂还具抗生物逆境的作用。本文对萜类化合物合成途径中GPPS基因及其启动子的功能进行初步研究,旨在为高产脂马尾松良种选育和分子育种提供帮助。本文以马尾松为试材,提取其总RNA,利用同源克隆技术获得马尾松GPPS基因的ORF,对其进行生物信息学分析。通过实时荧光定量分析PmGPPS基因在马尾松不同组织中的表达量,并分析马尾松幼苗在PEG 6000渗透胁迫、机械损伤、H2O2、Me JA、ETH和SA处理下PmGPPS基因的表达水平。克隆马尾松PmGPPS基因启动子片段,预测其所含的核心作用元件,构建启动子各缺失片段的重组质粒,在烟草叶片中进行瞬时表达分析。对PmGPPS基因进行原核表达分析,纯化出蛋白。并将PmGPPS基因转入拟南芥中分析叶绿素含量、酶活性及与萜类物质合成相关基因的表达量。结果如下:（1）PmGPPS基因ORF长度为1164 bp,编码387个氨基酸。理化性质分析结果表明:PmGPPS蛋白的分子式为C1850H3001N507O572S19,分子量为42.11 k Da,理论等电点（p I）为6.08,总亲水性平均数为-0.069,该蛋白为亲水性蛋白,蛋白质不稳定系数（II）为41.20,为不稳定蛋白。根据在线软件预测结果,初步推测PmGPPS蛋白是叶绿体定位蛋白且不含有信号肽序列,无跨膜结构。保守结构域预测结果表明PmGPPS蛋白属于类异戊二烯超家族成员。（2）马尾松PmGPPS基因在嫩叶中的表达量最高,其次是成熟叶。在渗透胁迫、机械损伤和SA处理下,PmGPPS基因表达量均在3 h时达到最高;在H2O2处理下,到24 h时表达量升到最高;ETH处理下的表达量在12 h时达到最高;在Me JA处理下,PmGPPS基因表达量在6 h时达到最高值。（3）马尾松PmGPPS基因启动子片段长为1690 bp,含有许多激素响应元件、参与光响应、防御和应激反应的顺式作用元件和参与干旱诱导的MYB结合位点等防御性元件,以及一些未知功能的元件。瞬时表达结果表明各缺失片段均能启动GUS基因的表达。在不同激素处理下,p BI121-PmGPPS-570 bp-GUS片段在Me JA处理下叶片颜色最深;p BI121-PmGPPS-1130 bp-GUS片段在Me JA和GA处理下叶片颜色相对较深;p BI121-PmGPPS-1690 bp-GUS片段在IAA处理下叶片颜色相对较深。（4）通过原核表达诱导出42.1 k Da左右大小的蛋白,纯化后得到一条条带大小正确且较为单一的目的蛋白。（5）转PmGPPS基因拟南芥中叶绿素的含量均高于野生型拟南芥,酶活性也普遍提高,最高可达52.74 IU/L,是野生型拟南芥的约1.28倍。在PmGPPS过表达的情况下,DXR及HDR的表达量略有所下降,HMGR的表达量无明显变化,而MK、PSY及TPS的表达量均有上升,尤其是TPS基因表达量上升最为明显,最高可达野生型表达量的40多倍。本文初步发现PmGPPS基因能响应一些非生物胁迫和激素处理,过表达可正向调控MVA和MEP通路上部分基因的表达,以促进合成更多的萜类化合物。
吴朝峰[3]（2020）在《棉花腺体形成相关基因GhERF105的功能分析》文中提出棉花是世界上最重要的经济作物之一,棉籽是纤维和蛋白的重要来源。然而,存在于色素腺体的棉酚毒素限制了棉籽的开发利用,长时间食用棉酚,会引起人和单胃动物消化系统的代谢紊乱。同时,棉酚又是棉花体内特有的天然毒素,能提高棉株对某些真菌、病害和虫害的拮抗作用。因此,挖掘色素腺体发生的相关基因、解析腺体形成的分子机制、选育低酚棉品种一直是育种家孜孜追求的目标和方向。基于棉花色素腺体2套近等基因系叶片转录组数据比较分析,我们获得了一个差异表达的AP2/ERF转录因子,命名为Gh ERF105。为了探究其功能,通过生物信息学、基因表达、乙烯诱导、VIGS、酵母单（双）杂等方法对其进行分析。主要研究结果如下:（1）Gh ERF105基因编码区全长711bp,编码236个氨基酸。蛋白质分子量为26.26k Da,理论p I 7.72。二级结构预测存在α-螺旋（22.88%）,β-转角（3.81%）,延伸链（13.14%）和无规则卷曲（60.17%）。Gh ERF105蛋白在第91-155个氨基酸之间存在1个AP2结构域。亚细胞定位预测Gh ERF105可能位于细胞核。进化树分析显示Gh ERF105蛋白与海岛棉、亚洲棉、陆地棉和雷蒙德氏棉中的同源蛋白的相似性较高,说明该类蛋白在棉属的进化中比较保守。（2）利用荧光定量PCR对无腺体和有腺体棉花材料及不同组织部位中Gh ERF105基因的表达情况进行分析。结果表明,Gh ERF105基因在有腺体陆地棉品种中棉所12、17、辽7和陆地棉遗传标准系TM-1的叶片和茎中相对表达量均高于显性无腺体品种中棉所12、辽7和隐性无腺体品种中棉所12、17。同时,该基因在有腺体陆地棉中棉所12子叶、真叶、叶柄、下胚轴、茎、花萼、花瓣及铃壳等部位的相对表达量明显高于无腺体棉中棉所12。推测Gh ERF105基因可能与腺体形成有关。（3）利用VIGS技术对Gh ERF105基因进行功能分析,发现Gh ERF105基因沉默后,有腺体中12植株新生的叶片腺体数目大幅度减少和棉酚含量降低。证明Gh ERF105基因参与叶片腺体形成和棉酚合成。（4）将Gh ERF105和GFP蛋白融合构建p BI121-Gh ERF105-GFP表达载体,将其注射烟草叶片进行亚细胞定位,结果发现Gh ERF105-GFP蛋白在烟草细胞核中表达。利用酵母单杂交实验证明Gh ERF105基因能够特异性识别和结合靶基因启动子上的GCC-box和DER作用元件,表明Gh ERF105是一个典型的ERF转录因子。（5）以有腺体陆地棉品种中棉所12和显性无腺体品种中棉所12为材料,克隆了Gh ERF105基因上游2000 bp的启动子序列并对其进行初步分析,生物信息学分析表明,Gh ERF105基因启动子序列中含有大量的TATA-box和CAAT-box保守元件,以及光调控元件,ABRE,ARE,ERE,GCN4-motif,TC-rich repeats等多个顺式作用元件。诱导表达分析表明Gh ERF105明显受乙烯利诱导上调表达,在喷施乙烯利8 h后,Gh ERF105表达量达到最高值,表明Gh ERF105基因参与到乙烯信号转导途径。（6）构建酵母诱饵表达载体p DHB1-Gh ERF105,并对其进行自激活和毒性检测。结果显示,诱饵蛋白Gh ERF105不能单独启动NMY51菌株中报告基因表达,并且对酵母细胞无毒性。通过酵母双杂交实验共筛选到52个可能与Gh ERF105互作的蛋白,挑选出7个蛋白质再次进行共转验证和α-galactosidase检测,结果表明这7个蛋白质均与Gh ERF105蛋白互作。同时,采用双分子荧光互补试验进一步确认了互作结果。综上所述,Gh ERF105基因可能通过乙烯信号通路来参与棉花色素腺体的形成,为解析棉花腺体形成的分子机制提供理论依据,为培育新的低酚棉品种提供候选基因和辅助筛选标记。
孙红梅[4]（2020）在《桑树（Morus alba）三个干旱诱导基因的表达规律及MaCDSP32基因的功能分析》文中认为桑树（Morus alba）根系发达,枝繁叶茂,生命力旺盛,具有较强的环境适应性,因此在世界范围内分布广泛。在我国,桑树作为生态防护林选用树种,可起到防沙固土,减少地表径流,保持原生态土壤结构的作用。另一方面,因桑树生长迅速,地上部分生物量大,被应用到自然生态修复系统中,例如修复被重金属污染的土壤、多石的贫瘠荒漠以及戈壁沙漠化区域等。桑树具有顽强的生存能力,源于其所拥有的独特生理特性,近年来在植物遗传学应用领域备受关注,涉及桑树抗逆基因资源挖掘及开发利用等研究。本研究从桑树中克隆得到3个干旱差异表达基因:叶绿体干旱胁迫诱导蛋白编码基因（chloroplast drought-induced stress protein of 32 k Da,Ma CDSP32）,IAA-氨基酸水解酶编码基因（ILR1-5（IAA-amino acid hydrolase ILR1-like 5,Ma ILR1）和抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase,Ma APX2））进行基因克隆、表达分析及基因功能分析,通过对目标序列的生物信息学分析、表达特性分析、转基因植株的抗逆性分析以及在干旱胁迫下的转录组数据分析,实现对目标基因在植物响应环境胁迫条件下分子功能的探索,为在未来以生物技术工程为手段改善植物的环境适应性和在实际生产中发挥桑树品种质资源优势等工作铺垫基石。本研究取得的主要结果如下:1.三个基因的克隆及亚细胞定位桑树中Ma CDSP32、Ma ILR1和Ma APX2基因的编码区长度分别为909 bp、1302 bp和750bp,分别编码303、434和250个氨基酸。预测结果显示,三个编码蛋白的亲水性和稳定性良好。Ma CDSP32编码的蛋白质定位在叶绿体基质中;Ma APX2编码的蛋白酶定位在细胞质内,主要富集在细胞膜和细胞核附近;Ma ILR1编码一个膜蛋白,为分泌型蛋白,定位在细胞膜上。2.三个基因在不同生长条件下的表达模式Ma CDSP32基因主要在桑树成熟叶片中表达,在桑树不同种间具有表达偏好性,但与基因组倍性无关;一天内,Ma CDSP32在15:00时达到表达高峰,呈生物钟节律表达规律;非生物胁迫和外源激素可诱导Ma CDSP32表达水平发生变化,但在叶片和根中表达模式不同。Ma ILR1基因主要在幼叶中表达,在桑树不同种间具有表达偏好性,但与基因组倍性无关;Ma ILR1无明显生物钟表达规律;非生物胁迫和外源激素可诱导Ma ILR1表达水平发生变化,但在叶片和根中表达模式不同。Ma APX2基因在地上部分表达量一致,在桑树不同种间具有表达偏好性,但与基因组倍性无关;一天内,Ma APX2在12:00时达到表达高峰,呈生物钟节律表达规律;非生物胁迫和外源激素可诱导Ma APX2表达水平发生变化,但在叶片和根中表达模式不同。3.Ma CDSP32瞬时表达桑叶的基因功能研究瞬时过表达Ma CDSP32的离体桑叶相比于未转化桑叶,在自然晾干过程中失水量增加。PEG模拟的水分胁迫下,桑叶中Ma MRSB、Ma P5CS、Ma PRX、Makds A、Ma DREB和Ma MAPK基因的表达水平以及ROS的积累量受Ma CDSP32过表达影响发生改变;盐胁迫下,桑叶中Ma WRKY、Makds A、Ma DREB和Ma MAPK基因的表达水平也受到Ma CDSP32过表达影响发生改变。这些结果表明Ma CDSP32会影响胁迫相关基因的表达水平,并参与植物非生物胁迫应答过程。4.Ma CDSP32在转基因烟草中的基因功能研究Ma CDSP32稳定转化烟草获得的转基因株系（OE-2和OE-7）与野生型烟草相比,在自然晾干过程其离体叶片失水量增加。转基因烟草对干旱敏感性增加,叶片中ROS积累和MDA含量增加,多种抗氧化酶活性降低,脯氨酸和可溶性糖积累减少;但复水后转基因植株的生长恢复能力增强,ROS积累减少,MDA含量减少,多种抗氧化酶活性增强,脯氨酸和可溶性糖积累增加。胁迫期间,转基因植株中Nt CAT、Nt ADC2、Nt LEA5和Nt MSRB基因的表达水平相对野生型发生改变。此外,Ma CDSP32通过促进转基因烟草种子和幼苗中Nt MSRB表达上调,减少ROS积累,显着增加了种子在渗透胁迫下的萌发率和幼苗生长。在盐胁迫下,叶绿素含量在Ma CDSP32转基因植株中增加,而在野生型植株中减少。这些结果揭示Ma CDSP32主要是通过参与氧化还原途径调节植物的抗逆性。5.Ma CDSP32在转基因拟南芥中的基因功能研究Ma CDSP32转基因拟南芥株系（OE-3和OE-9）与野生型拟南芥和At CDSP32突变拟南芥株系（mt-1和mt-2）相比,在干旱胁迫期间OE株系萎蔫较严重,ROS积累和MDA含量较多,SOD、POD和APX抗氧化酶活性较低。但OE株系相比野生型和突变体株系,在复水后成活率较高。在干旱和盐胁迫下,植株中不同Ma CDSP32或At CDSP32表达水平会影响At SOD、At POD、At CAT、At PRX、At APX2和At GR基因的表达水平。盐胁迫处理后,突变体株系的叶绿素含量相比野生型和OE株系降低。在渗透胁迫下OE拟南芥种子的萌发率较野生型和突变体种子显着增加。此外,OE拟南芥株系出现早花现象,其中At SOC1基因表达较野生型和突变体显着上调。这些结果表明Ma CDSP32主要是通过参与逆境应答的氧化还原途径影响植物的逆境生理和种子萌发过程,且Ma CDSP32通过影响At SOC1基因表达参与植物开花时间调节。6.Ma CDSP32过表达烟草干旱胁迫转录组学分析转基因烟草的转录组数据分析显示,在干旱处理期间,OE与WT株系差异表达基因主要集中在催化活性、核酸结合转录、转录因子活性、光合作用相关膜组件、糖类代谢进程和肽链内切酶调节因子酶活性等生理过程方面;复水后,OE与WT株系差异表达基因主要集中在高分子生物合成、氮化合物生物合成、催化活性和水解酶活性等生理过程方面。进一步分析发现,这些差异表达基因在苯丙素的生物合成、光合作用-触角蛋白、角质素,软木脂和蜡质的生物合成、核糖体和光合系统的固碳作用等通路中上调基因最多;这些差异表达基因在内质网蛋白加工、半乳糖代谢、倍半萜和三萜生物合成和脂肪酸延伸等通路中下调基因最多。此外,与WT株系相比,OE株系中在半胱氨酸和甲硫氨酸代谢途径、淀粉和糖类代谢途径、油菜素类固醇代谢途径、植物激素信号传导代谢途径和光合元件固碳作用代谢途径,以及抗氧化酶活性、脯氨酸合成代谢和糖合成代谢等方面所涉及的差异表达基因均出现干旱期间下调而复水后上调的变化趋势。推测这些差异表达基因是Ma CDSP32基因在干旱期间和复水后参与调节植物抗旱性相互作用的关键位点。综上,本研究得到的主要结果表明,桑树中的干旱持续表达基因Ma CDSP32通过参与植物抗逆过程中的ROS代谢调节过程,增强了植株的抗旱性,揭示了Ma CDSP32参与提高植物旱后恢复能力的分子机制。这项研究为桑树品种质资源优势的开发利用筛选了基因资源,为以分子生物技术手段改善植物的环境适应性和生存能力提供了新思路。
胡嘉祺[5]（2020）在《融合基因4CL1-CCR对烟草细胞壁影响的研究》文中研究说明4CL（4-香豆酸辅酶A连接酶,4-coumarate:coenzyme A ligase;）是连接苯丙烷代谢与木质素生物合成的交叉点酶,CCR（肉桂酰辅酶A还原酶,cinnamoyl-Co A reductase）是木质素特异生物合成的第一个酶,也是木质素生物合成的第一个限速酶。调控这两个基因的表达会影响植物体内“碳流”的流向。将这两个酶连接形成的双功能酶4CL1-CCR已在体外和原核生物体内证明了具有催化活性。但是外源基因在植物体内发挥的作用与其在原核生物中存在一定的差异,因此本研究在烟草中异源表达毛白杨的融合基因4CL1-CCR,对转基因烟草植株和悬浮细胞中木质素含量及沉积状态进行分析,并通过转录组分析阐述了融合基因影响烟草悬浮细胞木质化的过程。本研究得到了以下主要研究结果:（1）经硫代硫酸解结合高效气相色谱质谱联用对转基因烟草木质素单体含量分析发现,异源表达4CL1-CCR融合基因,不仅增加了烟草细胞壁中木质素的总含量,也可以改变木质素单体的组成。转基因烟草中G型木质素单体含量为14.34±0.52μg/mg显着高于WT的10.51±0.03μg/mg,但S型木质素的含量变化并不一致。（2）对转基因烟草茎的不同部位进行盐酸-间苯三酚染色发现,在转基因烟草茎顶端（幼嫩组织）木质部木质化的细胞已经成为一个闭合环状,而WT（野生型对照组）中相同位置并非所有细胞都表现出木质化的染色反应。对转基因烟草成熟组织进行染色观察发现,转基因烟草木质部宽度和导管内壁周长显着增加。（3）利用拉曼光谱技术对转基因烟草茎木质化的细胞进行mapping分析发现,转基因烟草木质素高密度沉积区的面积较WT有所升高,但分布区域仍为复合胞间层和细胞角隅;在次生细胞壁中木质素的沉积状态表现为低密度沉积。说明转入的融合基因增加了细胞壁中的木质素含量但并未改变木质素在细胞壁中的密度分布。（4）对转基因烟草悬浮细胞进行继代培养（MS+2,4-D 1.0mg/L）,发现外源基因没有影响到细胞生长周期,转基因悬浮细胞与WT有相同的生长曲线。但外源表达4CL1-CCR使得转基因悬浮细胞木质素积累提前,在继代培养第11天时转基因悬浮细胞已经可以观察到木质素的盐酸-间苯三酚染色反应,并且在继代培养到24天时染色反应加深,而WT细胞系在培养24天时依然不能被染色。应用GC-MS技术检测到在继代培养24天时的转基因烟草悬浮细胞中积累了少量G型木质素。通过对烟草发育的不同过程中木质素单体分析发现,转基因和WT烟草的发育过程中均为先积累G型木质素,然后随着组织的逐渐成熟S型木质素开始沉积到细胞壁区域内,并最终使G:S趋近于1。（5）通过RNA-seq对WT和转基因悬浮细胞不同继代培养时长的基因表达进行分析,结果显示在转基因烟草悬浮细胞中参与木质素合成的多个基因表达量有不同程度的上调。负责烟草细胞初生壁和次生壁中纤维素合成的基因表达量均有不同程度的下调,推测会使纤维素的合成减弱。在对生长素转运蛋白AUX家族成员基因的表达分析发现,转基因烟草悬浮细胞中此家族成员基因的表达受到严重抑制,阻碍了外源添加的2,4-D向细胞内转运,胞内低浓度生长素无法激活生长素响应因子（auxin response factor）,最终导致生长素信号传导途径的下游目标基因表达受影响。对烟草木质素合成基因相关转录因子分析发现烟草的myb-releated protein 306和myb-releated protein 315表达量升高,其中myb-releated protein 306可能参与调控了细胞由增殖向分化的转化过程,myb-releated protein 315则直接参与调控木质素单体合成相关基因的表达,最终使转基因悬浮细胞出现较早的木质素沉积现象。本实验通过将融合基因转入烟草中补充了融合基因在植物体内发挥作用的实验数据,并利用悬浮细胞结合转录组分析从分子角度解释了融合基因4CL1-CCR对烟草细胞形态及木质化过程的影响。
苑瑜瑾[6]（2020）在《依赖R2R3 MYB的生长素信号转导通路调控番茄表皮毛形成》文中研究表明植物表皮毛是特化的表皮细胞,也是植物自我保护的屏障。拟南芥表皮毛通常是单细胞的,有分支的和非分泌型的。拟南芥表皮毛发育受转录因子复合体的控制,此复合体由R2R3 MYB、WD40 repeat（WDR）和basic helix–loop–helix（b HLH）转录因子家族蛋白组成。番茄多细胞表皮毛发育机制和拟南芥单细胞发育机制不同,发育机制尚不明确。生长素作为最早发现的植物激素,控制植物生长的方方面面。生长素喷施番茄秧苗可大幅提高叶片表面Ⅱ型,Ⅴ型和Ⅵ表皮毛的密度。Aux/IAA蛋白和ARF蛋白在生长素信号转导过程中发挥了重要作用。ARF家族转录因子可发挥转录激活或抑制作用。本研究对番茄生长素响应基因SlARF4以及其下游调控网络进行了分析,主要结果如下:（1）定量PCR结果表明:SlARF4基因在番茄各组织中均有表达,在表皮毛组织中表达水平最高。GUS启动子染色表明:SlARF4基因在番茄叶片表面Ⅱ型,Ⅴ型,Ⅵ型表皮毛组织中均有表达。SlARF4基因转基因株系具有以下表型。第一,对番茄叶片完全展开和未完全展开两个阶段分析表明,超量表达SlARF4基因后番茄叶片表面Ⅱ型,Ⅴ型和Ⅵ型表皮毛密度增加。抑制表达SlARF4基因可降低上述三种表皮毛密度。第二,超量表达SlARF4基因增加了表皮细胞的密度;抑制表达SlARF4基因降低了表皮细胞的密度。超量表达SlARF4基因上述三种表皮毛和表皮细胞的比值增加。抑制表达SlARF4基因后上述三种表皮毛和表皮细胞的比值降低。第三,抑制表达SlARF4基因降低了番茄植株对生长素处理的响应能力。第四,气相色谱-质谱连用技术（GC-MS）结果表明:SlARF4正向调控了叶片提取物中萜类物质（y-Elemene、β-Caryophyllene和α-humulene）含量。SlARF4基因超量表达株系抗害虫朱砂叶螨能力增强;SlARF4基因抑制表达株系抗朱砂叶螨能力减弱。（2）RNA-Seq方法分析了RNAi-SlARF4转基因株系转录组的变化。RNA-Seq鉴定了398个差异表达基因,包括在RNAi株系中的275个上调表达基因和123个下调表达的基因。其中,SlTHM1基因启动子区域具有生长素作用原件Aux RE（TGTCTC）;SlMYB52基因启动子区域含有TGA作用原件（AACGAC）。凝胶阻滞（EMSA）,双荧光素酶和免疫共沉淀（ChIP）实验表明:SlARF4结合SlTHM1和SlMYB52基因的启动子并且抑制了他们的表达。杂交实验结果表明:SlARF4依赖SlTHM1和SlMYB52基因发挥对表皮毛的调控作用。（3）SlTHM1基因在番茄各组织中均有表达,在表皮毛组织中表达水平最高。GUS启动子染色表明:SlTHM1基因在叶片表面Ⅱ型,Ⅵ型表皮毛组织中表达,在Ⅴ型表皮毛中不表达。SlTHM1定位在细胞核中,并具有转录激活活性。番茄中,抑制表达SlTHM1基因可特异性增加Ⅱ型和Ⅵ型表皮毛密度,表皮细胞密度,Ⅱ型和Ⅵ型表皮毛和表皮细胞的比值以及番茄植株对生长素的响应能力。抑制表达SlTHM1基因还增强了萜类物质的含量和番茄植株对朱砂叶螨的抗性。SlMYB52基因在番茄各组织中均有表达。GUS启动子染色表明:SlMYB52基因在叶片表面Ⅴ型表皮毛组织中特异性表达,在其他类型表皮毛中不表达。SlMYB52定位在细胞核中。番茄中,抑制表达SlMYB52基因可特异性增加Ⅴ型表皮毛密度,表皮细胞密度,Ⅴ型表皮毛和表皮细胞的比值以及番茄植株对生长素的响应能力。抑制表达SlMYB52基因不改变番茄植株对朱砂叶螨的抗性。（4）SlCycB2是B类型细胞周期蛋白,在表皮毛的形成、萜类物质代谢以及植株抗逆性中发挥了关键作用。EMSA和双荧光素酶的实验结果表明:SlTHM1和SlMYB52可结合SlCycB2基因启动子并激活了它的表达。SlIAA15基因敲除突变体中Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型表皮毛的密度极显着高于野生型。EMSA和双荧光素酶的实验结果表明:SlTHM1和SlMYB52可结合SlIAA15基因启动子并激活了其表达。综上所述,R2R3 MYB生长素信号转导通路在调控番茄表皮毛叶片形成发育过程中发挥了重要作用。生长素诱导SlARF4基因表达,SlARF4蛋白抑制了下游SlTHM1和SlMYB52基因表达。SlTHM1和SlMYB52通过调控下游基因SlCycB2和SlIAA15分别调控了番茄叶片表面多细胞和单细胞表皮毛的形成。Ⅱ型和Ⅵ型表皮毛密度增加增强了番茄植株对朱砂叶螨的抗性,为使用基因工程手段增强植物抗生物胁迫能力提供了新的策略。
张静[7]（2020）在《大豆GmCBL4基因启动子和GmCBL10基因的克隆及遗传转化》文中提出钙调磷酸酶B亚基蛋白（calcineurin B-like protein,CBL）是一种钙结合蛋白,在植物逆境信号传导中发挥重要功能。CBL蛋白和与其相互作用的蛋白激酶CIPK（CBL-interacting protein kinase）是CBL/CIPK信号系统的基本要素。该信号系统在植物高盐、干旱以及低温等非生物胁迫中起着关键作用。钙离子作为植物中一种必不可少的第二信使,在植物遭受逆境胁迫通过其浓度的时空变化来传导胁迫信号,CBL蛋白能够感知逆境Ca2+信号,并与Ca2+结合,进而激活其下游蛋白激酶CIPK,并与其形成CBL-CIPK复合体,对转录因子及胁迫应答基因进行调节,调控不同细胞水平以及组织部位的抗逆性,从而帮助植物应对逆境胁迫带来的影响。驱动基因表达的启动子是转录水平调控基因表达的重要元件,对启动子结构与功能的深入研究有助于了解基因在植物生长发育与逆境防御中的作用机制,进而为有针对性的进行植物的抗逆改良提供依据。本研究从大豆中克隆GmCBL4基因启动子（CblP1）全长及其不同长度5’缺失片段,并分别构建植物表达载体,转化烟草,为启动子功能分析奠定了基础;同时克隆了大豆GmCBL10基因并转化烟草,为该基因的功能分析和利用转基因技术培育大豆抗逆品种奠定了基础。本研究的主要研究结果如下:1.根据植物基因组数据库Phytozome中大豆GmCBL4基因上游序列设计引物,从大豆中克隆得到GmCBL4基因启动子序列,序列长度为1876bp,命名为CblP1。通过启动子在线分析软件PLACE和PlantCARE预测发现,该序列中含有保守结构域TATA-box和CAAT-box,以及一些非生物胁迫应答顺式作用元件（MBS干旱诱导相关元件、LTR低温诱导相关元件）、光诱导信号转导元件、激素应答顺式作用元件以及花粉发育特异性激活元件等,预测结果表明该启动子具有逆境胁迫诱导特性。构建了该启动子驱动的植物双元表达载体pCAMBIA1301-CblP1通过农杆菌介导转化烟草,获得2株CblP1融合gus报告基因的阳性转化植株。2.为寻找该启动子的核心功能区,进一步对该启动子进行5’端缺失分析,克隆了4个不同长度的5’端缺失片段,序列长度分别为1399bp（Cbl P2）、932bp（CblP3）550bp（CblP4）和248bp（CblP5）,并分别构建5’端缺失片段驱动的植物双元表达载体,分别为pCAMBIA1301-Cbl P2、pCAMBIA1301-CblP3、pCAMBIA1301-CblP4和pCAMBIA1301-CblP5,通过农杆菌介导转化烟草,获得2株CblP3融合gus报告基因的阳性植株。3.利用农杆菌介导法将5种启动子植物表达载体分别对烟草进行瞬时转化,经过GUS组织化学染色分析发现,全长启动子序列CblP1（1876bp）和5’缺失启动子序列CblP2（1399bp）、CblP3（932bp）具有启动活性,且CblP3启动活性最强;CblP4（550bp）和CblP5（248bp）无启动活性。推测该启动子核心功能区可能位于-932-550区域内。4.以大豆RNA反转录的cDNA为模板,从大豆中克隆获得了大豆GmCBL10基因序列,全长1049bp,其中ORF区792bp,共编码263个氨基酸。对该基因所编码蛋白的理化性质、二级结构、信号肽、跨膜结构域及亚细胞定位预测分析,发现该蛋白属于酸性、亲水性蛋白,无信号肽,含有典型的EF-hand结构域和1个跨膜结构域,主要定位于细胞质和线粒体中。系统进化分析表明,GmCBL10与菜豆中同源蛋白的亲缘关系最近。克隆带有同源重组接头的大豆GmCBL10基因CDS序列,通过同源重组的方法构建了植物表达载体pCPB-GmCBL10,冻融法转化农杆菌EHA105,叶盘法转化烟草,经PCR鉴定获得3株阳性转GmCBL10基因植株。
邓晶[8]（2020）在《大豆GmRIQ2基因上游启动子克隆及其功能分析》文中研究表明植物基因工程在增强植物抗逆性、提高作物产量以及改良品质等方面发挥重要的作用,常常需要外源基因在受体植物中进行异源表达。而启动子可与转录因子结合并协调作用调控下游基因的表达模式及程度。并且,对启动子的深入研究还可以加强人们对植物生长发育各个阶段中植物内部调控过程的分子机制的了解,因此启动子已在植物基因工程中得到广泛地应用。有研究预测RIQ基因N末端的转运肽能够特异靶向叶绿体,并且存在高度保守且功能未知的结构域1118,该基因编码的蛋白能够特异定位于类囊体膜上,通过调节基粒堆叠的程度以优化捕光复合物II结构,最终对植物起到光保护的作用。本课题组前期从大豆基因组中分离得到Gm RIQ2基因,研究发现该基因CDS序列全长为585 bp,编码194个氨基酸,具备跨膜结构,属于膜蛋白,其蛋白定位于叶绿体。而且在植物光保护及抗旱调节中发挥作用,并推测可能参与种子产量的负调控过程。如通过对基因的启动子进行分析,可以更全面深入地研究基因功能。因此本研究以大豆垦丰16为材料,提取基因组DNA并运用PCR技术分离得到Gm RIQ2基因的启动子序列;构建植物表达载体并转化大豆及拟南芥;运用5’端缺失法获得三个不同长度的Gm RIQ2基因启动子缺失片段,分别构建缺失片段表达载体并转化拟南芥;通过生物信息学、组织化学染色、GUS酶活性检测及荧光定量PCR的一系列分析,对Gm RIQ2基因启动子的结构及功能进行初步分析,旨在明确该启动子的调控基础及其调控基因表达时其内部功能元件的调节作用,为研究Gm RIQ2基因的功能和作用机理奠定良好的科学基础。研究结果如下:1、通过PCR扩增获得长度为1661 bp的大豆Gm RIQ2基因启动子,命名为PGm RIQ2,通过Plant CARE在线分析网站发现该启动子序列中不仅含大量基础调控元件:TATA-box和CAAT-box,还存在生长素响应基序Aux RR-core,参与茉莉酸甲酯反应的响应基序TGACG-motif和CGTCA-motif,与脱落酸诱导有关的调控元件ABRE,种子特异性表达元件RY-element,厌氧感应调节元件ARE以及若干参与光反应的调控基序:ATCT-motif、BoxⅡ、G-box、GATA-motif和TCT-motif。2、构建Gm RIQ2基因全长启动子的植物表达载体,利用发根农杆菌介导转化大豆子叶节,GUS染色发现Gm RIQ2基因全长启动子能驱动GUS基因在大豆根系中表达,表明该启动子具有启动活性,并且其发根转化率和阳性诱导率与Ca MV35S启动子无明显差异。3、Gm RIQ2基因全长启动子的植物表达载体转化拟南芥,GUS组织化学染色发现Gm RIQ2基因全长启动子能驱动报告基因在转基因拟南芥全株表达,且在莲座叶维管组织中存在高效表达的优势,生育初期具有明显的时空表达特性。4、根据生物信息学分析结果,结合序列上顺式作用元件分布及元件功能预测,通过5’端缺失法,扩增获得三个长度分别为450 bp、284 bp和194 bp的Gm RIQ2基因启动子缺失片段。构建三个含Gm RIQ2基因启动子缺失片段的植物表达载体,采用花序浸泡法分别转化拟南芥,GUS染色表明Gm RIQ2基因启动子缺失片段均能驱动报告基因在拟南芥中表达,其表达水平与缺失片段长度正相关,但在莲座叶维管组织中仍具有表达优势。5、将获得的转基因拟南芥分别用50μM/L生长素、100μM/L脱落酸和100μM/L茉莉酸甲酯进行激素处理,用300μmolm-2·s-1光照强度处理,经GUS酶活性检测发现Gm RIQ2基因全长启动子可以应答生长素、脱落酸、茉莉酸甲酯及光信号的诱导,并初步确定生长素、脱落酸和茉莉酸甲酯的应答元件分别位于-1661～-450 bp、-450～-284 bp和-284～-194 bp,初步推断该启动子具有诱导型启动子特性。6、将大豆KF16分别用50μM/L生长素、100μM/L脱落酸和100μM/L茉莉酸甲酯进行激素处理,经q RT-PCR检测,结果表明Gm RIQ2基因受生长素、脱落酸和茉莉酸甲酯的负调控。
周炎[9]（2020）在《烟草硝酸还原酶基因NIA启动子的克隆及其互作蛋白的筛选》文中指出为了更好的调控硝酸根同化过程和硝酸信号的响应,筛选鉴定烟草中硝酸还原酶基因NIA1启动子、NIA2启动子的互作蛋白以及假定顺式元件NRE2的结合蛋白,本实验以烟草基因组为模板,选取NIA基因上游1 kb左右片段,设计引物,克隆烟草NIA基因启动子片段,构建瞬时表达载体用于鉴定。以普通烟草品种K326为材料,依照Clontech公司的酵母单杂交系统筛选方法完成了 K326酵母单杂交cDNA文库的构建及NIAl基因启动子、NIA2基因启动子和4×NRE2顺式元件的转录因子筛选。结果表明,经过生物信息学分析及瞬时转染GUS基因鉴定,所克隆NIA上游片段具有启动子功能。酵母单杂交文库构建成功。经测序比对,NIA1启动子、NIA2启动子、4×NRE2片段分别筛选出8、3、3个cDNA序列,分别对其进行生物信息学分析,结果显示14个蛋白基因序列中有12个为烟草同源基因,利用PredictProtein在线工具对比对到的阳性克隆氨基酸序列进行分析预测。结合位点预测结果表明,NIA1启动子诱饵片段筛选到的5个阳性克隆蛋白序列和NIA2启动子诱饵片段筛选到的2个以及4×NRE2诱饵片段筛选到的2个共9个阳性克隆蛋白序列同时含有DNA/RNA结合区以及蛋白质结合区,具有与核酸序列和蛋白质结合的功能,可满足转录因子结构中的DNA结合域要求。其余阳性克隆蛋白序列中都存在多个蛋白结合位点,可能与其他蛋白形成配体后共同参与调控某些生命过程,但其具体功能尚需进一步验证。
殷金瑶[10]（2020）在《橡胶树白粉菌启动子WY172的克隆、功能鉴定及其对HpaXm的调控分析》文中研究指明受体细胞中外源基因的表达是植物基因工程中的关键问题,启动子是基因表达的重要调控序列之一,是基因表达调控的关键点。本研究中,通过生物信息学分析得到了一个来自橡胶树白粉菌（Oidium heveae B.A.Steinm.）的疑似内源启动子,命名为WY172。通过瞬时表达、GUS染色实验、GUS活性分析等对该启动子功能进行验证,引入外源功能基因HpaXm,通过稳定表达、微过敏、烟草花叶病毒（TMV）接种、实时荧光定量PCR、GUS活性检测等实验对WY172驱动HpaXm基因的表达效果进行探究,并通过诱导元件分析、诱导实验和GUS染色等对WY172的启动子类型进行了分析;采取对WY172启动子上游2K序列进行渐变缺失突变、诱导元件分析和启动子活性分析等方法进行分析,探究WY172是否具有多元化诱导的可能性。主要结果如下:1.获得了重组表达载体pBI121-GFP（转空载体）、pBI121-ACT1（阳性对照）、pBI121-WY172,证明WY172具有启动子功能,可以驱动报告基因GUS的表达,并且在单子叶植物水稻和双子叶植物烟草中均能发挥启动子作用。2.构建了pBI121-WY172-HpaXm及带有35S的pBI121-HpaXm（阳性对照）植物表达载体,转化获得相应的转基因烟草。微过敏和TMV接种实验证明WY172能够有效地驱动外源功能基因HpaXm的表达,其转基因植物的过敏性反应和抗病性强于阳性对照。同时,这个结果也预示TMV可能诱导WY172的表达,WY172可能是诱导性启动子。3.生物信息学分析,WY172具有生长素响应元件,同时具有光响应元件和两个未知功能的顺式作用元件。诱导实验及qRT-PCR等证明,生长素能够很好诱导WY172的表达,说明WY172可能是一种IAA诱导型启动子。4.克隆了橡胶树白粉菌启动子WY172上游2K序列上4个不同长度缺失片段,GUS染色及酶活性测定结果均显示所有缺失突变片段都具有调控基因表达的启动子活性,且启动活性均强于35S启动子,其中WY172Q3调控GUS基因表达的活性最高。同时发现,WY172启动子上游2K序列具有茉莉酸甲酯响应、赤霉素响应、低温响应等丰富的顺式作用元件。综上所述,本研究得到了橡胶树白粉菌内源启动子WY172,它在单子叶植物水稻和双子叶植物烟草中均能高效表达,并且可能受IAA和TMV的双重诱导,可能具有广泛宿主范围和很高应用潜力。
二、GUS基因分泌型植物表达载体的构建及对烟草的转化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、GUS基因分泌型植物表达载体的构建及对烟草的转化（论文提纲范文）
（1）芸薹属基本种扩展蛋白基因家族的进化分析及花粉发育相关扩展蛋白基因的功能分化研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 植物扩展蛋白基因家族的研究进展 |
| 1.1.1 扩展蛋白的结构特点和起源 |
| 1.1.1.1 扩展蛋白的结构特点 |
| 1.1.1.2 扩展蛋白基因的起源 |
| 1.1.2 不同植物扩展蛋白基因家族成员的比较 |
| 1.1.3 进化过程中扩展蛋白基因亚家族的基因结构和结构域较保守 |
| 1.1.4 扩展蛋白基因在染色体上广泛分布 |
| 1.1.5 染色体片段重复是扩展蛋白基因家族主要扩张模式 |
| 1.1.6 扩展蛋白基因在不同植物组织中的表达丰度不同 |
| 1.2 扩展蛋白在植物生长发育中的作用 |
| 1.2.1 扩展蛋白基因在植物营养生长中的功能 |
| 1.2.1.1 种子萌发 |
| 1.2.1.2 根的生长发育 |
| 1.2.1.3 叶片的生长发育 |
| 1.2.2 扩展蛋白基因在植物生殖生长中的功能和调控 |
| 1.2.2.1 花粉管发育 |
| 1.2.2.2 果实成熟软化 |
| 1.3 花粉内壁的发育和调控 |
| 1.3.1 花粉壁的形成 |
| 1.3.2 花粉内壁发育的调控 |
| 1.3.2.1 参与拟南芥花粉内壁发育的基因及其调控机制 |
| 1.3.2.2 参与水稻花粉内壁发育的基因及其调控机制 |
| 1.4 花粉管的发育和调控 |
| 1.4.1 花粉管壁的组成和发育 |
| 1.4.2 细胞壁组分对花粉管生长的影响 |
| 1.4.2.1 果胶合成 |
| 1.4.2.2 纤维素合成 |
| 1.4.3 花粉管生长过程中细胞壁的重塑 |
| 1.4.3.1 细胞壁扩展蛋白和糖苷酶水解蛋白 |
| 1.4.3.2 阿拉伯半乳糖蛋白 |
| 1.4.3.3 果胶甲酯酶和果胶乙酰化酶 |
| 1.4.4 花粉管细胞壁结构蛋白的信号通路 |
| 1.4.4.1 细胞壁结构蛋白LRXs |
| 1.4.4.2 快速碱化因子家族RALFs |
| 1.4.4.3 类受体激酶CrRLK1Ls——ANX1/2和BUPS1/2 |
| 2 芸薹属三个基本种扩展蛋白基因家族的鉴定和进化分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 植物材料和主要试剂 |
| 2.1.2 扩展蛋白家族成员的鉴定和理化性质预测 |
| 2.1.3 扩展蛋白家族成员系统发育遗传树的构建与结构分析 |
| 2.1.4 扩展蛋白家族基因的染色体分布、共线性和保留率分析 |
| 2.1.5 扩展蛋白家族基因编码序列和启动子的进化分析 |
| 2.1.6 扩展蛋白家族基因的表达分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 芸薹属基本种扩展蛋白基因家族的鉴定 |
| 2.2.2 扩展蛋白基因的系统发育、基因结构和功能域分析 |
| 2.2.3 扩展蛋白基因的染色体分布、复制机制和保留比例 |
| 2.2.4 扩展蛋白基因的编码序列和启动子的进化分析 |
| 2.2.5 扩展蛋白家族成员的表达模式 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 全基因组三倍化后芸薹属三个基本种的扩展蛋白基因家族规模 |
| 2.3.2 芸薹属三个基本种中EXLB亚家族在进化上最为保守 |
| 2.3.3 启动子的变异与扩展蛋白基因的编码序列进化密切相关 |
| 2.3.4 扩展蛋白基因在白菜生殖发育中可能扮演重要的角色 |
| 3 白菜扩展蛋白基因BrEXPB4和BrEXPB9 的表达模式和功能鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料和主要试剂 |
| 3.1.2 CTAB法提取基因组DNA |
| 3.1.3 总RNA 的提取(试剂盒法)与cDNA 的合成 |
| 3.1.4 BrEXPB4和BrEXPB9 的基因编码序列和启动子序列的扩增 |
| 3.1.5 氨基酸序列的特征分析 |
| 3.1.6 荧光定量PCR分析 |
| 3.1.7 proBrEXPB4::GUS和 proBrEXPB9::GUS融合表达载体的构建 |
| 3.1.8 BrEXPB4::eGFP和 BrEXPB9::eGFP融合表达载体的构建 |
| 3.1.9 人工microRNA(amiRNA)载体的构建 |
| 3.1.9.1 amiRNA序列的设计与合成 |
| 3.1.9.2 p35S::ami REXPB4/9、p35S::amiREXPB4和p35S::ami REXPB9 载体的构建 |
| 3.1.10 proBrEXPB4::GUS和 proBrEXPB9::GUS载体的遗传转化 |
| 3.1.10.1 proBrEXPB4::GUS和 proBrEXPB9::GUS载体浸花法转化野生型拟南芥 |
| 3.1.10.2 阳性转基因拟南芥植株的筛选 |
| 3.1.10.3 阳性植株组织的GUS染色观察 |
| 3.1.11 BrEXPB4和BrEXPB9 的亚细胞定位 |
| 3.1.11.1 利用烟草表皮细胞瞬时转化体系观察目标蛋白的亚细胞定位 |
| 3.1.11.2 利用洋葱表皮细胞瞬时转化体系观察目标蛋白的亚细胞定位 |
| 3.1.12 利用抽真空浸花法将amiRNA载体转化‘油青四九’菜心 |
| 3.1.13 菜心阳性转基因植株的筛选鉴定 |
| 3.1.13.1 转基因菜心基因组DNA的提取 |
| 3.1.13.2 利用PCR对转基因菜心植株进行初次筛选 |
| 3.1.13.3 利用qRT-PCR对转基因菜心植株进行再次筛选 |
| 3.1.14 阳性转基因菜心植株的表型观察 |
| 3.1.14.1 植株的形态学观察和角果长度的统计 |
| 3.1.14.2 花粉的细胞学染色观察 |
| 3.1.14.3 花粉的扫描电镜观察 |
| 3.1.14.4 花粉的半薄切片和透射电镜观察 |
| 3.1.14.5 花粉的体内萌发 |
| 3.1.14.6 花粉的体外萌发 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 成功扩增‘油青四九’菜心中BrEXPB4和BrEXPB9 的编码序列和启动子序列 |
| 3.2.2 BrEXPB4和BrEXPB9 主要在成熟花粉粒和花粉管中表达 |
| 3.2.2.1 BrEXPB4和BrEXPB9 主要在‘Bcajh97-01’的花序、三核花粉期以及授粉受精后优势表达 |
| 3.2.2.2 BrEXPB4和BrEXPB9 从单核晚期花粉中起始表达并持续到花粉管中 |
| 3.2.3 BrEXPB4和BrEXPB9 定位在细胞壁上 |
| 3.2.4 BrEXPB4和BrEXPB9 定位在细胞壁上 |
| 3.2.5 同时抑制BrEXPB4和BrEXPB9 的表达造成花粉和花粉管的发育异常 |
| 3.2.5.1 利用amiRNA技术实现对菜心中BrEXPB4和BrEXPB9 的表达抑制 |
| 3.2.5.2 抑制BrEXPB4和BrEXPB9 的表达不会影响菜心的营养生长和花器官形态 |
| 3.2.5.3 同时抑制BrEXPB4和BrEXPB9 的表达导致花粉败育以及花粉萌发和伸长异常 |
| 3.2.5.4 BrEXPB4/9~(KD)的花粉败育发生在单核花粉晚期,导致花粉内容物含量降低并伴随异常的内壁沉积 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 BrEXPB4和BrEXPB9 具有相似的表达模式和亚细胞定位 |
| 3.3.2 BrEXPB4和BrEXPB9 冗余地参与白菜花粉发育和花粉管萌发 |
| 3.3.3 BrEXPB4和BrEXPB9 通过调控花粉内壁的沉积影响花粉管的萌发 |
| 4 拟南芥EXPA4和EXPB5 的表达模式和功能鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 植物材料和主要试剂 |
| 4.1.2 CTAB法提取基因组DNA |
| 4.1.3 总RNA 的提取与cDNA 的合成 |
| 4.1.3.1 Trizol法提取总RNA |
| 4.1.3.2 cDNA的合成 |
| 4.1.4 AtEXPA4和AtEXPB5 的基因全长序列、编码序列和启动子序列的扩增 |
| 4.1.5 氨基酸序列的特征分析和启动子顺式作用元件分析 |
| 4.1.6 荧光定量PCR分析 |
| 4.1.7 proAtEXPA4::GUS和 proAtEXPB5::GUS融合表达载体的构建 |
| 4.1.8 AtEXPA4::eGFP和 AtEXPB5::eGFP融合表达载体的构建 |
| 4.1.9 AtEXPA4和AtEXPB5 敲除载体的构建 |
| 4.1.9.1 AtEXPA4和AtEXPB5 sgRNA的设计合成及中间载体的构建 |
| 4.1.9.2 构建以proYAO启动子驱动Cas9 表达的CRISPR/Cas9 载体 |
| 4.1.10 过表达载体proAtEXPA4::EXPA4和proAtEXPB5::EXPB5 的构建 |
| 4.1.11 利用浸花法将各载体转化野生型拟南芥以及T_1代抗性植株的筛选 |
| 4.1.11.1 通过浸花法对拟南芥进行遗传转化 |
| 4.1.11.2 T_1代抗性植株的筛选 |
| 4.1.12 proAtEXPA4::GUS和 proAtEXPB5::GUS植株的筛选和观察 |
| 4.1.13 AtEXPA4和AtEXPB5 的亚细胞定位 |
| 4.1.13.1 利用烟草表皮细胞瞬时转化体系观察目标蛋白的亚细胞定位 |
| 4.1.13.2 利用洋葱表皮细胞瞬时转化体系观察目标蛋白的亚细胞定位 |
| 4.1.14 敲除植株的筛选鉴定 |
| 4.1.14.1 通过PCR检测敲除植株的T-DNA插入情况 |
| 4.1.14.2 敲除植株的基因编辑检测 |
| 4.1.14.3 敲除纯合植株的筛选 |
| 4.1.15 双突变体atexpa4expb5 的获得和F_2代基因分离比的统计 |
| 4.1.16 利用PCR和 qRT-PCR对过表达植株进行筛选和鉴定 |
| 4.1.17 双突变体atexpa4expb5 的回补实验 |
| 4.1.17.1 过表达载体proAtEXPA4::EXPA4和proAtEXPB5::EXPB5对atexpa4expb5 的遗传转化 |
| 4.1.17.2 利用PCR和 qRT-PCR对回补植株进行筛选 |
| 4.1.18 敲除、过表达以及回补植株的表型观察 |
| 4.1.18.1 植株的形态学观察 |
| 4.1.18.2 花粉的细胞学染色观察 |
| 4.1.18.3 花粉的扫描电镜观察 |
| 4.1.18.4 花粉的体内萌发 |
| 4.1.18.5 主根长度和根尖分生区长度的测量与统计 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 AtEXPA4和AtEXPB5 的基因全长序列、编码序列和启动子序列 |
| 4.2.2 AtEXPA4和AtEXPB5 的表达分析 |
| 4.2.3 AtEXPA4和AtEXPB5 定位在细胞壁上 |
| 4.2.4 AtEXPA4和AtEXPB5 突变体、过表达以及回补植株的获得 |
| 4.2.4.1 atexpa4和atexpb5株系T-DNA插入和基因编辑类型的统计 |
| 4.2.4.2 AtEXPA4和AtEXPB5 敲除植株的脱靶检测 |
| 4.2.4.3 通过杂交获得AtEXPA4和AtEXPB5 双突变体atexpa4expab5 |
| 4.2.4.4 导入过表达载体使野生型拟南芥和atexpa4expab5 中相应基因的表达量升高 |
| 4.2.5 AtEXPA4和AtEXPB5 的同时突变使花粉管伸长速度减缓 |
| 4.2.5.1 AtEXPA4和AtEXPB5 的突变和过量表达对植株形态和花粉发育未观察到显着影响 |
| 4.2.5.2 双突变体atexpa4expab5 的花粉管伸长速度减缓 |
| 4.2.5.3 AtEXPA4和AtEXPB5 的突变对花粉的竞争力和配子传递无明显影响 |
| 4.2.6 AtEXPA4或AtEXPB5 都可以恢复atexpa4expab5 花粉管的伸长速度 |
| 4.2.7 AtEXPA4 促进主根的伸长 |
| 4.2.8 AtEXPA4和AtEXPB5 的启动子上顺式作用元件的分布情况 |
| 4.2.9 AtEXPA4和AtEXPB5 的启动子上顺式作用元件的分布情况 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 AtEXPA4和AtEXPB5 冗余地参与花粉管的发育 |
| 4.3.2 AtEXPA4 参与主根的生长发育 |
| 4.3.3 AtEXPA4和AtEXPB5 可能在MYB转录因子的调控下参与花粉管的发育 |
| 5 AtEXPA4和AtEXPB5 与其白菜中的同源基因的功能分化 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 植物材料和主要试剂 |
| 5.1.2 转录因子TDF1、AMS和 MYB结合位点的分析 |
| 5.1.3 酵母单杂交实验 |
| 5.1.3.1 TFs-AD和 proBrEXPB4A-E-AbAi、proBrEXPB9A-C-Ab Ai、pAtEXPB5A-Ab Ai载体的构建 |
| 5.1.3.2 线性化启动子载体并转化Y1H感受态细胞 |
| 5.1.3.3 检测转录因子对目的基因的调控作用 |
| 5.1.4 双荧光素酶实验 |
| 5.1.4.1 报告器载体proBrEXPB4-LUC、proBrEXPB9-LUC、pAtEXPB5A-LUC和效应器载体TFs-SK的构建 |
| 5.1.4.2 效应器和报告器质粒电击法转化农杆菌GV3101(MP90)感受态细胞 |
| 5.1.4.3 效应器和报告器载体瞬时转化烟草叶片并检测荧光强度 |
| 5.1.5 qRT-PCR分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 TDF1和AMS对白菜EXPB4/9 和拟南芥EXPB5 的转录激活分析 |
| 5.2.2 其他转录因子与BrEXPB4和BrEXPB9 的启动子结合分析 |
| 5.2.3 BrEXPA11/19/22 的表达模式及其在BrEXPB4/9~(KD)中的表达分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 AtEXPB5 与其在白菜中的同源基因BrEXPB4和BrEXPB9 产生功能分化 |
| 5.3.2 AtEXPB5和BrEXPB4/9 参与不同的调控路径 |
| 5.3.3 白菜扩展蛋白基因家族在进化过程中产生功能分化 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表的论文 |
（2）马尾松GPPS基因及其启动子功能分析（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 1 立题依据 |
| 1.1 马尾松及松脂概况 |
| 1.1.1 马尾松概况 |
| 1.1.2 松脂合成机理 |
| 1.1.3 松脂合成相关基因的研究 |
| 1.2 植物启动子的研究进展 |
| 1.2.1 启动子简介 |
| 1.2.2 植物启动子的研究进展 |
| 1.3 异戊烯基转移酶基因家族与GPPS基因研究现状 |
| 1.3.1 异戊烯基转移酶基因家族研究现状 |
| 1.3.2 GPPS基因研究现状 |
| 1.4 研究目的与意义和技术路线 |
| 1.4.1 研究目的与意义 |
| 1.4.2 技术路线 |
| 2 试验材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌种及载体 |
| 2.1.3 试剂与试剂盒 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.1.6 引物合成与测序 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 PmGPPS基因的克隆及定量表达分析 |
| 2.2.2 PmGPPS基因启动子克隆及瞬时表达分析 |
| 2.2.3 PmGPPS基因原核表达 |
| 2.2.4 PmGPPS基因遗传转化初步分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 PmGPPS基因的克隆及定量表达分析 |
| 3.1.1 马尾松总RNA的提取 |
| 3.1.2 PmGPPS基因ORF的克隆 |
| 3.1.3 PmGPPS基因的生物信息学分析 |
| 3.1.4 实时荧光定量表达分析 |
| 3.2 PmGPPS基因启动子克隆及瞬时表达分析 |
| 3.2.1 PmGPPS启动子片段的克隆 |
| 3.2.2 PmGPPS启动子生物信息学分析 |
| 3.2.3 重组质粒的构建 |
| 3.2.4 烟草瞬时表达分析 |
| 3.3 PmGPPS基因原核表达 |
| 3.3.1 pEASY-Blunt E2-PmGPPS载体构建 |
| 3.3.2 原核表达分析及蛋白纯化 |
| 3.4 PmGPPS基因遗传转化初步分析 |
| 3.4.1 pCAMBIA-PmGPPS-1302 载体构建 |
| 3.4.2 转基因拟南芥的鉴定 |
| 3.4.3 叶绿素含量分析 |
| 3.4.4 GPPS酶活性分析 |
| 3.4.5 转基因拟南芥中萜类物质合成相关基因的表达分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PmGPPS基因的克隆及定量表达分析 |
| 4.2 PmGPPS基因启动子克隆及瞬时表达分析 |
| 4.3 PmGPPS基因原核表达 |
| 4.4 PmGPPS基因遗传转化初步分析 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 附录二 |
（3）棉花腺体形成相关基因GhERF105的功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 棉花色素腺体和棉酚 |
| 1.1.1 棉花色素腺体性状 |
| 1.1.2 棉酚的结构和特性 |
| 1.1.3 色素腺体与棉酚的关系 |
| 1.1.4 色素腺体研究的重要性 |
| 1.2 色素腺体性状控制基因的遗传研究 |
| 1.2.1 棉花色素腺体相关控制基因遗传研究 |
| 1.2.2 棉花色素腺体相关复等位基因的遗传研究 |
| 1.3 显性无腺体基因GL_2~e的研究 |
| 1.3.1 GL_2~e基因的发现与遗传分析 |
| 1.3.2 GL_2~e基因的研究进展 |
| 1.4 棉花色素腺体发育相关基因的克隆 |
| 1.5 棉酚生物合成途径及相关基因的研究 |
| 1.5.1 棉酚的生物合成途径 |
| 1.5.2 棉酚生物合成途径中有关基因的研究 |
| 1.6 低酚棉育种进展 |
| 1.7 植物ERF转录因子研究进展 |
| 1.7.1 ERF转录因子 |
| 1.7.2 ERF类转录因子转录激活活性的调控 |
| 1.7.3 ERF转录因子在非生物胁迫中的作用 |
| 1.7.4 ERF转录因子在生物胁迫中的作用 |
| 1.8 VIGS技术在验证基因功能中的应用 |
| 1.8.1 VIGS技术简介 |
| 1.8.2 VIGS技术在棉花基因功能研究中的应用 |
| 1.9 DUALhunter酵母双杂交系统简介及应用 |
| 1.10 双分子荧光互补技术(BiFC)及其应用 |
| 1.11 研究目的与意义 |
| 第二章 腺体形成相关的候选基因GhERF105克隆与功能分析 |
| 2.1 实验仪器、材料与方法 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验材料 |
| 2.1.3 菌株和表达载体 |
| 2.1.4 实验试剂 |
| 2.1.5 棉苗的培育 |
| 2.1.6 棉花总RNA提取 |
| 2.1.7 cDNA合成及质量验证 |
| 2.1.8 质粒大量提取 |
| 2.1.9 PCR产物扩增 |
| 2.1.10 PCR产物纯化 |
| 2.1.11 热击法转化大肠杆菌感受态 |
| 2.1.12 菌液PCR |
| 2.1.13 测序与序列比对 |
| 2.1.14 重组质粒小量提取 |
| 2.1.15 冻融法转化农杆菌感受态 |
| 2.1.16 棉酚含量测定 |
| 2.1.17 荧光定量PCR结果统计分析 |
| 2.1.18 候选基因生物信息学分析 |
| 2.1.19 qRT-PCR验证候选基因在有腺体和无腺体材料中的差异性表达 |
| 2.1.20 病毒诱导的基因沉默(VIGS)筛选棉花腺体相关基因 |
| 2.1.21 陆地棉GhERF105基因组织特异性分析 |
| 2.1.22 陆地棉GhERF105基因在有腺体和无腺体序列分析 |
| 2.1.23 候选基因GhERF105启动子的作用元件分析 |
| 2.1.24 陆地棉GhERF105基因启动子在有腺体和无腺体序列分析 |
| 2.1.25 陆地棉GhERF105基因诱导表达分析 |
| 2.1.26 陆地棉GhERF105蛋白亚细胞定位 |
| 2.1.27 酵母双杂交 |
| 2.1.28 互作蛋白亚细胞定位 |
| 2.1.29 双分子荧光互补(BiFC)验证 |
| 2.1.30 酵母单杂交 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 RNA纯度检测 |
| 2.2.2 陆地棉GhERF105基因克隆 |
| 2.2.3 陆地棉GhERF105生物信息学分析 |
| 2.2.4 陆地棉候选基因GhERF105在不同棉花品种叶茎差异性表达 |
| 2.2.5 利用VIGS方法获得棉花沉默候选基因植株 |
| 2.2.6 陆地棉GhERF105基因组织特异性分析 |
| 2.2.7 陆地棉GhERF105基因诱导表达分析 |
| 2.2.8 陆地棉GhERF105蛋白的亚细胞定位 |
| 2.2.9 陆地棉GhERF105基因在不同棉花材料叶片中序列分析 |
| 2.2.10 陆地棉GhERF105基因启动子作用元件分析、序列和活性分析 |
| 2.2.11 陆地棉Gh ERF105 基因与Gh MYC2-like的关系 |
| 2.2.12 酵母双杂交筛选互作蛋白 |
| 2.2.13 互作蛋白的亚细胞定位 |
| 2.2.14 Bi FC验证Gh ERF105 与互作蛋白的互作 |
| 2.2.15 Gh ERF105与GCC-box及 DRE顺式作用元件结合和转录激活活性的分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 陆地棉GhERF105蛋白序列分析 |
| 2.3.2 陆地棉GhERF105基因表达分析 |
| 2.3.3 陆地棉GhERF105基因与腺体形成或棉酚代谢的关系 |
| 2.3.4 陆地棉GhERF105基因启动子序列分析 |
| 2.3.5 陆地棉GhERF105基因诱导表达分析 |
| 2.3.6 陆地棉GhERF105基因其他功能分析 |
| 2.3.7 陆地棉GhERF105基因作用机制推测 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 后续研究与展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 引物序列汇表 |
| 附录B 实验试剂和培养基配制 |
| 附录C 候选基因的功能注释 |
| 附录D 互作蛋白的功能注释 |
| 附录E 作者介绍 |
| 致谢 |
（4）桑树（Morus alba）三个干旱诱导基因的表达规律及MaCDSP32基因的功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 干旱对植物生长的影响 |
| 1.2 植物抗旱性的研究进展 |
| 1.2.1 植物的抗旱性与旱后复水恢复生长的调节机制 |
| 1.2.2 植物的抗旱性评价体系及提高植物抗逆性的需求和措施 |
| 1.3 植物非生物胁迫下的氧化还原调节系统 |
| 1.3.1 非生物胁迫对植物氧化还原系统的影响 |
| 1.3.2 非生物胁迫下植物细胞中ROS的产生和代谢 |
| 1.4 植物硫氧还蛋白家族(Trxs)及其广泛作用 |
| 1.4.1 Trxs功能概况 |
| 1.4.2 叶绿体中的Trxs系统 |
| 1.4.3 叶绿体中一种类硫氧还蛋白-CDSP32 |
| 1.5 植物胞质抗坏血酸过氧化物酶(APX)研究进展 |
| 1.6 植物生长素氨基酸水解酶家族(ILR-like)研究进展 |
| 1.7 参与植物抗逆性几种胁迫应答因子的研究进展 |
| 1.7.1 脯氨酸参与抗逆性的研究进展 |
| 1.7.2 甜菜碱参与抗逆性的研究进展 |
| 1.7.3 可溶性糖类参与抗逆性的研究进展 |
| 1.7.4 脱落酸(ABA)参与抗逆性的研究进展 |
| 1.7.5 超氧化物歧化酶(SOD)参与抗逆性的研究进展 |
| 1.8 桑树抗逆性及资源应用研究进展 |
| 1.8.1 古老的桑树物种及其生存能力 |
| 1.8.2 桑树资源应用发展现状 |
| 1.8.3 桑树抗旱性分子机制研究进展 |
| 1.9 本研究前期工作基础和技术依据 |
| 1.9.1 前期工作基础 |
| 1.9.2 技术流程 |
| 第二章 桑树中MaCDSP32、MaILR1和MaAPX2 基因克隆和序列分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 主要仪器设备 |
| 2.2.3 主要试剂及菌株 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 桑树叶片总RNA提取与鉴定 |
| 2.3.2 桑树叶片cDNA合成 |
| 2.3.3 基因克隆 |
| 2.3.4 序列的生物信息学分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 桑树中三个基因编码区克隆及测序 |
| 2.4.2 核酸和氨基酸序列的生物信息学分析 |
| 2.4.3 编码蛋白的系统发育树分析 |
| 2.4.4 GO(Gene ontology)数据库预测目标基因功能 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 MaCDSP32、MaILR1和MaAPX2 的表达模式分析及多克隆抗体制备 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 植物材料与胁迫处理 |
| 3.2.2 主要试剂耗材及仪器 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 总RNA提取和反转录cDNA |
| 3.3.2 基因定量引物设计 |
| 3.3.3 实时荧光定量qRT-PCR |
| 3.3.4 叶片含水量测定 |
| 3.3.5 脯氨酸含量测定 |
| 3.3.6 原核表达载体的构建 |
| 3.3.7 多克隆抗体制备 |
| 3.3.8 多克隆抗体效价检测 |
| 3.3.9 数据统计分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 基因在桑树地上部分组织的表达规律 |
| 3.4.2 基因在不同桑树品种中的表达规律 |
| 3.4.3 基因在桑树中的生物钟节律表达规律 |
| 3.4.4 盐胁迫对基因表达水平的影响 |
| 3.4.5 高温胁迫对基因表达水平的影响 |
| 3.4.6 水分胁迫对基因表达水平的影响 |
| 3.4.7 施加外源ABA对基因表达水平的影响 |
| 3.4.8 施加外源乙烯利对基因表达水平的影响 |
| 3.4.9 施加外源水杨酸对基因表达水平的影响 |
| 3.4.10 氨基酸序列的抗原性分析 |
| 3.4.11 基因表达与蛋白纯化 |
| 3.4.12 多克隆抗体效价检测 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 MaCDSP32、MaILR1和MaAPX2 的瞬时表达分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 植物表达载体构建 |
| 4.3.2 重组质粒转化农杆菌 |
| 4.3.3 基因瞬时转化桑叶的处理方式 |
| 4.3.4 qRT-PCR检测基因表达量 |
| 4.3.5 叶片中H_2O_2和O_2~-的含量测定 |
| 4.3.6 转化烟草的亚细胞定位分析 |
| 4.3.7 数据统计分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 基因瞬时转化浸染后离体桑叶的状态 |
| 4.4.2 基因产物的亚细胞定位 |
| 4.4.3 瞬时表达MaCDSP32 基因对离体桑叶持水能力的影响 |
| 4.4.4 MaCDSP32 瞬时表达离体桑叶的自然失水情况 |
| 4.4.5 NaCl胁迫下离体桑叶气孔开度的变化 |
| 4.4.6 PEG胁迫下离体桑叶气孔开度的变化 |
| 4.4.7 PEG处理下胁迫相关基因表达量的变化 |
| 4.4.8 NaCl处理下胁迫相关基因表达量的变化 |
| 4.4.9 基因产物的亚细胞定位确认 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 桑树MaCDSP32 转化烟草的功能研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 植物材料和生长条件 |
| 5.2.2 主要试剂和耗材 |
| 5.2.3 主要仪器 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 叶盘法转化烟草及转基因烟草鉴定 |
| 5.3.2 MaCDSP32 表达产物亚细胞定位 |
| 5.3.3 转基因烟草非生物胁迫处理 |
| 5.3.4 转基因烟草种子萌发和幼苗生长处理 |
| 5.3.5 丙二醛、脯氨酸、可溶性糖和甜菜碱含量测定 |
| 5.3.6 叶片中ROS的组织定位和含量测定 |
| 5.3.7 SOD、APX、POD和 CAT抗氧化酶活性测定 |
| 5.3.8 光合作用气体交换参数测定 |
| 5.3.9 叶绿色素含量测定 |
| 5.3.10 数据统计分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 CDSP32序列在桑树和烟草中的同源性比对 |
| 5.4.2 阳性转基因烟草PCR鉴定 |
| 5.4.3 MaCDSP32 表达产物的亚细胞定位 |
| 5.4.4 MaCDSP32 对转基因烟草抗逆性的影响 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 桑树MaCDSP32 转化拟南芥的功能研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 试验材料 |
| 6.2.1 植物材料和生长条件 |
| 6.2.2 主要试剂和耗材 |
| 6.2.3 主要仪器 |
| 6.3 试验方法 |
| 6.3.1 构建MaCDSP32 过表达拟南芥植株 |
| 6.3.2 突变体拟南芥T-DNA插入鉴定 |
| 6.3.3 转基因拟南芥种子胁迫处理 |
| 6.3.4 转基因拟南芥植株非生物胁迫处理 |
| 6.3.5 生理生化指标测定 |
| 6.3.6 拟南芥叶片气孔开度测量 |
| 6.3.7 数据统计分析 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 MaCDSP32和AtCDSP32 序列同源性分析 |
| 6.4.2 AtCDSP32 突变体拟南芥植株鉴定 |
| 6.4.3 转基因拟南芥株系在非生物胁迫下的抗逆性分析 |
| 6.4.4 干旱胁迫对转基因拟南芥气孔开度的影响 |
| 6.4.5 非生物胁迫对转基因拟南芥抗氧化物酶活性的影响 |
| 6.4.6 非生物胁迫对拟南芥抗氧化物酶编码基因表达量的影响 |
| 6.4.7 渗透胁迫对拟南芥种子萌发及幼苗生长的影响 |
| 6.4.8 MaCDSP32 过表达拟南芥植株的早花现象 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 MaCDSP32 转基因烟草干旱胁迫转录组数据分析 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 试验材料 |
| 7.2.1 植物材料 |
| 7.2.2 胁迫处理方式及取样 |
| 7.3 试验方法 |
| 7.3.1 样品转录组文库构建 |
| 7.3.2 上机测序 |
| 7.3.3 信息分析流程 |
| 7.4 结果与分析 |
| 7.4.1 OE和WT烟草干旱样品转录组数据总体分析 |
| 7.4.2 OE和WT烟草干旱转录组样品差异表达基因分析 |
| 7.4.3 OE和WT烟草干旱转录组差异表达基因维恩图 |
| 7.4.4 OE和WT烟草干旱转录组差异表达基因聚类热图 |
| 7.4.5 OE和WT烟草干旱差异表达基因GO富集分析 |
| 7.4.6 OE和WT烟草复水差异表达基因KEGG通路分析 |
| 7.4.7 半胱氨酸和甲硫氨酸代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
| 7.4.8 淀粉和糖代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
| 7.4.9 油菜素类固醇代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
| 7.4.10 植物激素信号传导代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
| 7.4.11 光合元件固碳作用代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
| 7.4.12 硫代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
| 7.5 干旱和复水相反生理参数涉及差异表达基因GO富集分析 |
| 7.6 小结 |
| 第八章 结论 |
| 8.1 本研究总结 |
| 8.2 本研究创新点 |
| 8.3 有待进一步研究的问题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）融合基因4CL1-CCR对烟草细胞壁影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 1 引言 |
| 1.1 植物细胞壁结构与主要组分 |
| 1.1.1 植物细胞壁结构 |
| 1.1.2 植物细胞壁的主要成分 |
| 1.1.3 木质素的用途 |
| 1.1.4 木质素的生物合成 |
| 1.2 融合基因及其应用 |
| 1.3 植物悬浮细胞在木质化研究中的应用 |
| 1.3.1 植物悬浮细胞木质化 |
| 1.3.2 生长素抑制植物悬浮细胞木质化 |
| 1.3.3 生长素影响转录因子引起的细胞分化 |
| 1.4 研究技术路线 |
| 2 融合基因对烟草茎木质素的影响 |
| 引言 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 植物表达载体构建 |
| 2.2.2 4CL1-CCR的农杆菌转化及烟草侵染 |
| 2.2.3 转基因烟草的筛选和鉴定 |
| 2.2.4 转基因烟草的木质素分析 |
| 2.2.5 转基因烟草表型和茎木质化观测 |
| 2.2.6 转基因烟草茎木质素的拉曼光谱观测 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 植物表达载体构建及叶盘法转化 |
| 2.3.2 转融合基因4CL1-CCR烟草的分子鉴定 |
| 2.3.3 转基因烟草的木质素组成分析 |
| 2.3.4 转基因烟草植株表型观测 |
| 2.3.5 转基因烟草的茎光学显微观测 |
| 2.3.6 转基因烟草的茎拉曼光谱检测 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 融合基因4CL1-CCR对烟草悬浮细胞壁的影响 |
| 引言 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 仪器设备 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 转基因烟草悬浮细胞系的建立与继代培养 |
| 3.2.2 转基因烟草悬浮细胞木质素测定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 转基因烟草悬浮细胞系的建立与继代培养 |
| 3.3.2 转基因烟草悬浮细胞系生长曲线 |
| 3.3.3 转基因烟草悬浮细胞系的形态观测 |
| 3.3.4 转基因烟草悬浮细胞木质素特异染色 |
| 3.3.5 转基因烟草不同发育阶段木质素测定 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 融合基因4CL1-CCR对烟草悬浮细胞壁形成基因表达的影响 |
| 引言 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 转基因烟草悬浮细胞 |
| 4.1.2 仪器设备 |
| 4.1.3 试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 转基因烟草悬浮细胞总RNA提取及c DNA合成 |
| 4.2.2 转基因烟草悬浮细胞转录组测序与分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 转基因烟草总RNA质量检测 |
| 4.3.2 RNA-seq质量分析 |
| 4.3.3 Reads与烟草基因组比对情况 |
| 4.3.4 差异表达基因分析 |
| 4.3.5 差异表达基因Gene Ontology富集分析 |
| 4.3.6 融合基因4CL1-CCR对木质素合成基因表达的影响 |
| 4.3.7 木质素单体聚合作用增强 |
| 4.3.8 转基因悬浮细胞纤维素合成作用减弱 |
| 4.3.9 融合基因4CL1-CCR抑制生长素运输及响应因子相关基因表达 |
| 4.3.10 融合基因4CL1-CCR对 ABC家族基因表达的影响 |
| 4.3.11 与木质素单体糖基化相关基因分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 烟草次生壁合成相关转录因子分析 |
| 前言 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 烟草悬浮细胞 |
| 5.1.2 仪器设备 |
| 5.1.3 试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 烟草MYB克隆与载体构建 |
| 5.2.2 类水滑石LDH介导重组质粒转化烟草悬浮细胞 |
| 5.2.3 转基因烟草悬浮细胞的鉴定与继代 |
| 5.2.4 转基因烟草悬浮细胞形态学观察 |
| 5.2.5 木质素合成基因的半定量PCR鉴定 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 烟草MYB进化分析 |
| 5.3.2 烟草悬浮细胞的分子鉴定 |
| 5.3.3 烟草悬浮细胞的形态学观察 |
| 5.3.4 转基因烟草悬浮细胞木质素合成相关基因表达分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 讨论 |
| 6.1 融合基因4CL1-CCR增强烟草细胞壁木质化 |
| 6.2 融合基因打破2,4-D对烟草悬浮细胞木质化的抑制 |
| 6.3 融合基因对烟草悬浮细胞基因转录水平的影响 |
| 6.3.1 融合基因抑制生长素转运基因表达 |
| 6.3.2 融合基因对生长素相应因子的影响 |
| 6.3.3 转基因悬浮细胞木质素聚合能力增强 |
| 6.3.4 融合基因减弱纤维素的合成与果胶甲酯化 |
| 6.3.5 融合基因对ABC家族基因表达的影响 |
| 6.3.6 转录因子MYB增强木质素合成基因的表达 |
| 7 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
| 获得成果目录清单 |
| 致谢 |
（6）依赖R2R3 MYB的生长素信号转导通路调控番茄表皮毛形成（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词列表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 文献综述及国内外研究进展 |
| 1.1.1 植物虫害和表皮毛关系 |
| 1.1.2 表皮毛形成、分布、分化、发育机制 |
| 1.1.3 番茄表皮毛分类 |
| 1.1.4 生长素信号转导通路 |
| 1.1.5 ARF家族基因研究进展 |
| 1.2 研究目的与意义 |
| 1.2.1 研究目的 |
| 1.2.2 研究意义 |
| 1.3 研究内容与技术路线 |
| 1.3.1 研究内容 |
| 1.3.2 技术路线 |
| 2 番茄生长素响应基因SlARF4功能及其对下游基因调控研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 生长素处理促进了番茄叶片中Ⅱ型,Ⅴ型,Ⅵ型表皮毛的形成 |
| 2.3.2 番茄生长素信号转导基因ARF家族基因序列分析 |
| 2.3.3 生长素响应基因SlARF4表达模式分析 |
| 2.3.4 SlARF4基因正向调控了番茄叶片中Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型表皮毛的形成 |
| 2.3.5 SlARF4基因调控了萜类物质的代谢 |
| 2.3.6 SlARF4基因调控了番茄植株对朱砂叶螨的抗性 |
| 2.3.7 RNAi-SlARF4转基因番茄叶片的转录组分析 |
| 2.3.8 SlARF4结合SlTHM1和SlMYB52基因的启动子并且抑制了他们的表达 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 番茄SlTHM1和SlMYB52基因功能及其对下游基因调控研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 SlTHM1基因组织表达模式,转录激活活性和亚细胞定位分析 |
| 3.3.2 SlTHM1基因可负调控番茄叶片中Ⅱ型,Ⅵ型表皮毛形成 |
| 3.3.3 下调SlTHM1基因表达可增加萜类物质的含量并且增强番茄植株对朱砂叶螨的抗性 |
| 3.3.4 SlMYB52基因组织表达模式和亚细胞定位分析 |
| 3.3.5 SlMYB52基因可特异性负调控番茄叶片中Ⅴ型表皮毛形成 |
| 3.3.6 下调SlMYB52基因表达不影响番茄植株对朱砂叶螨的抗性 |
| 3.3.7 SlTHM1和SlMYB52正向调控SlCycB2基因的表达 |
| 3.3.8 SlIAA15可负调控番茄叶片中Ⅱ型,Ⅴ型,Ⅵ型表皮毛的形成 |
| 3.3.9 SlTHM1和SlMYB52正向调控SlIAA15基因的表达 |
| 3.3.10 SlARF4依赖SlTHM1基因发挥对番茄叶片Ⅱ型和Ⅵ型表皮毛的调控作用 |
| 3.3.11 SlARF4依赖SlMYB52基因发挥对番茄叶片Ⅴ型表皮毛的调控作用 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 结论与展望 |
| 4.1 主要结论 |
| 4.1.1 表皮毛数目增加可以增强番茄植株对朱砂叶螨的抗性 |
| 4.1.2 生长素促进了单细胞和多细胞表皮毛的形成 |
| 4.1.3 SlARF4通过直接结合SlMYB52和SlTHM1调控单细胞和多细胞表皮毛的发育 |
| 4.1.4 SlTHM1和SlMYB52通过和SlCycB2和SlIAA15直接结合发挥对表皮毛的调控作用 |
| 4.2 本研究创新点 |
| 4.3 后续工作展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| A.作者在攻读博士学位期间发表的论文目录 |
| B.作者在攻读博士学位期间申请的专利 |
| C.作者在攻读博士学位期间参加的科研项目目录 |
| D.第二章所使用的引物序列 |
| E.第三章所使用的引物序列 |
| F.学位论文数据集 |
| 致谢 |
（7）大豆GmCBL4基因启动子和GmCBL10基因的克隆及遗传转化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 植物基因启动子概述 |
| 1.1.1 植物基因启动子的结构 |
| 1.1.2 植物基因启动子的分类 |
| 1.2 植物基因启动子的研究方法 |
| 1.2.1 植物基因启动子的克隆方法 |
| 1.2.2 植物基因启动子的生物信息学分析 |
| 1.2.3 植物基因启动子的表达方法 |
| 1.3 植物CBL基因家族研究进展 |
| 1.3.1 CBL基因的蛋白结构 |
| 1.3.2 CIPK的蛋白结构 |
| 1.3.3 CBL与 CIPK作用机制 |
| 1.3.4 CBL的功能 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 1.5 技术路线 |
| 第2章 大豆GmCBL4基因启动子全长序列的克隆及植物表达载体构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料与试剂 |
| 2.2.2 GmCBL4基因启动子全长序列的克隆及生物信息学分析 |
| 2.2.3 GmCBL4基因全长启动子植物表达载体的构建 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 GmCBL4基因启动子全长序列生物信息学分析 |
| 2.3.2 GmCBL4基因启动子全长序列的克隆 |
| 2.3.3 GmCBL4基因全长启动子植物表达载体构建 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 大豆GmCBL4基因启动子5’缺失片段的克隆及植物表达载体构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料与试剂 |
| 3.2.2 GmCBL4基因启动子5’缺失片段的克隆 |
| 3.2.3 GmCBL4基因5’缺失启动子植物表达的载体 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 GmCBL4基因启动子5’缺失片段的克隆 |
| 3.3.2 GmCBL4基因5’缺失启动子植物表达的载体 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 大豆GmCBL4基因启动子全长及5’缺失片段对烟草的遗传转化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料与试剂 |
| 4.2.2 重组植物表达载体转化农杆菌EHA105 |
| 4.2.3 农杆菌介导的烟草遗传转化 |
| 4.2.4 农杆菌介导的烟草瞬时转化 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 重组植物表达载体转化农杆菌的鉴定 |
| 4.3.2 转基因植株的鉴定 |
| 4.3.3 GUS组织化学染色分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 大豆GmCBL10基因的克隆及遗传转化 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与试剂 |
| 5.2.1 植物材料 |
| 5.2.2 菌种与质粒 |
| 5.2.3 实验仪器及试剂 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 大豆cDNA的获取 |
| 5.3.2 大豆GmCBL10基因的克隆 |
| 5.3.4 序列分析 |
| 5.3.5 构建pCPB-GmCBL10 植物表达载体 |
| 5.3.6 重组植物表达载体pCPB-GmCBL10 转化农杆菌EHA105 |
| 5.3.7 烟草的遗传转化 |
| 5.3.8 转基因烟草的鉴定 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 大豆GmCBL10基因的克隆 |
| 5.4.2 大豆GmCBL10蛋白的生物信息学分析 |
| 5.4.3 pCPB-GmCBL10 植物表达载体的构建 |
| 5.4.4 烟草的遗传转化 |
| 5.5 本章小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（8）大豆GmRIQ2基因上游启动子克隆及其功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 植物启动子 |
| 1.2 植物启动子的基本结构 |
| 1.2.1 核心启动子 |
| 1.2.2 上游启动子区 |
| 1.3 启动子的类型 |
| 1.3.1 组成型启动子 |
| 1.3.2 诱导型启动子 |
| 1.3.3 组织特异性启动子 |
| 1.4 启动子的克隆方法 |
| 1.4.1 常规PCR技术 |
| 1.4.2 探针载体筛选启动子 |
| 1.4.3 基于PCR技术克隆启动子 |
| 1.4.4 基因组文库筛选启动子 |
| 1.5 启动子的研究方法 |
| 1.5.1 生物信息学分析与预测 |
| 1.5.2 瞬时表达分析 |
| 1.5.3 稳定表达分析 |
| 1.5.4 点突变 |
| 1.5.5 凝胶阻滞分析 |
| 1.6 RIQ基因的研究进展 |
| 1.7 本研究的目的与意义 |
| 1.8 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌种及载体 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.1.5 数据分析 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 GmRIQ2基因启动子全长序列及缺失片段的克隆 |
| 2.2.2 GmRIQ2基因启动子全长序列分析 |
| 2.2.3 植物表达载体转化农杆菌 |
| 2.2.4 发根农杆菌介导转化大豆子叶节 |
| 2.2.5 农杆菌介导花序浸泡法转化拟南芥 |
| 2.2.6 GUS组织染色和定量分析 |
| 2.2.7 转基因拟南芥的激素和逆境处理 |
| 2.2.8 大豆KF16植株的激素处理 |
| 2.2.9 大豆Gm RIQ2 基因的实时荧光定量PCR分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 大豆GmRIQ2基因启动子的克隆及生物信息学分析 |
| 3.1.1 大豆GmRIQ2基因启动子序列的获得 |
| 3.1.2 大豆GmRIQ2基因启动子的生物信息学分析 |
| 3.2 大豆GmRIQ2基因启动子植物表达载体构建及农杆菌转化 |
| 3.2.1 植物表达载体构建 |
| 3.2.2 重组植物表达载体转化农杆菌及鉴定 |
| 3.3 pCAMBIA3301Gm RIQ2::GUS转化大豆子叶节及鉴定 |
| 3.3.1 转基因大豆子叶节的获得 |
| 3.3.2 转基因大豆根PCR检测 |
| 3.3.3 转基因大豆根GUS活性组织化学检测 |
| 3.3.4 转基因大豆根的诱导转化效率 |
| 3.4 pCAMBIA3301Gm RIQ2::GUS转化拟南芥及鉴定 |
| 3.4.1 转基因拟南芥的获得 |
| 3.4.2 转基因拟南芥PCR检测 |
| 3.4.3 转基因拟南芥GUS活性组织化学检测 |
| 3.5 大豆GmRIQ2基因启动子缺失片段的克隆及转化拟南芥的鉴定 |
| 3.5.1 大豆GmRIQ2基因启动子缺失片段的获得 |
| 3.5.2 大豆GmRIQ2基因启动子缺失片段植物表达载体构建 |
| 3.5.3 大豆GmRIQ2基因启动子缺失片段表达载体转化农杆菌 |
| 3.5.4 大豆GmRIQ2基因启动子缺失片段表达载体转化拟南芥 |
| 3.6 GmRIQ2基因全长及各缺失片段启动子的功能分析 |
| 3.6.1 激素处理的转基因拟南芥GUS酶活性检测 |
| 3.6.2 逆境处理的转基因拟南芥GUS酶活性检测 |
| 3.7 激素处理的GmRIQ2基因在大豆中的表达量分析 |
| 3.7.1 大豆RNA的提取 |
| 3.7.2 生长素(IAA)对Gm RIQ2 基因表达量的影响 |
| 3.7.3 脱落酸(ABA)对Gm RIQ2 基因表达量的影响 |
| 3.7.4 茉莉酸甲酯(Me JA)对Gm RIQ2 基因表达量的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 GUS基因在启动子活性分析中的应用 |
| 4.2 5'缺失法构建启动子缺失片段 |
| 4.3 GmRIQ2基因启动子的序列分析 |
| 4.4 GmRIQ2基因启动子的维管组织表达特异性 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（9）烟草硝酸还原酶基因NIA启动子的克隆及其互作蛋白的筛选（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 烟草氮素研究进展 |
| 1.1.1 氮素对烟草生长发育的影响 |
| 1.1.2 氮素同化过程 |
| 1.1.3 硝酸还原酶的研究进展 |
| 1.2 启动子 |
| 1.2.1 启动子的结构与类型 |
| 1.2.2 启动子研究方法 |
| 1.3 转录因子 |
| 1.3.1 转录因子的结构 |
| 1.3.2 转录因子的功能 |
| 1.3.3 转录因子研究方法 |
| 1.4 酵母单杂交 |
| 1.4.1 酵母单杂交的原理 |
| 1.4.2 酵母单杂交的主要步骤 |
| 1.4.3 酵母单杂交的优缺点 |
| 2 引言 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 试验材料及仪器 |
| 3.2 烟草基因组模板的获得 |
| 3.3 NIA1、NIA2基因启动子片段的克隆 |
| 3.4 诱饵序列的获得 |
| 3.5 启动子重组载体构建及植株转化 |
| 3.6 GUS活性分析及酶联免疫反应定量分析 |
| 3.7 运用SMART~（TM）技术构建烟草K326品种cDNA文库 |
| 3.8 诱饵载体的构建和诱饵报告菌株的获得 |
| 3.9 报告基因本底表达水平的测定 |
| 3.10 酵母单杂交文库的构建和初步筛选 |
| 3.11 阳性互作的确认和质粒的提取鉴定 |
| 3.12 互作蛋白的生物信息学分析 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 NIA1与NIA2基因启动子片段的克隆 |
| 4.2 NIA1及NIA2基因启动子序列分析 |
| 4.2.1 NIA1基因启动子序列分析 |
| 4.2.2 NIA2基因启动子序列分析 |
| 4.3 GUS组织染色及定量分析结果 |
| 4.4 诱饵报告菌株的PCR鉴定 |
| 4.5 诱饵报告菌株的AbA背景抑制浓度测定 |
| 4.6 烟草K326 cDNA文库构建结果 |
| 4.7 酵母单杂交文库的初步筛选结果 |
| 4.8 酵母质粒的提取与鉴定 |
| 4.9 NIA启动子片段结合蛋白的生物信息学分析 |
| 4.9.1 NIA1启动子片段筛选阳性克隆生物信息学分析 |
| 4.9.2 NIA2启动子片段筛选阳性克隆生物信息学分析 |
| 4.9.3 4×NRE2诱饵片段筛选阳性克隆生物信息学分析 |
| 4.9.4 阳性克隆三维结构同源建模及进化树的构建 |
| 5 结论与讨论 |
| 5.1 所克隆的NIA1与NIA2上游片段有启动子基本功能且功能强弱受NRE2元件影响 |
| 5.2 三个诱饵片段均筛选到多个阳性克隆 |
| 5.3 筛选的部分阳性克隆被预测有转录因子功能 |
| 5.4 结论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
（10）橡胶树白粉菌启动子WY172的克隆、功能鉴定及其对HpaXm的调控分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 启动子结构 |
| 1.1.1 原核生物启动子结构 |
| 1.1.2 真核生物启动子结构 |
| 1.2 启动子分类 |
| 1.2.1 组成型启动子 |
| 1.2.2 组织特异型启动子 |
| 1.2.3 诱导型启动子 |
| 1.3 丝状真菌启动子研究进展 |
| 1.3.1 丝状真菌启动子简述 |
| 1.3.2 曲霉属的glaA启动子 |
| 1.3.3 构巢曲霉的gpdA启动子 |
| 1.4 启动子分析方法 |
| 1.4.1 生物信息学预测 |
| 1.4.2 酵母单杂分析 |
| 1.4.3 瞬时表达 |
| 1.4.4 稳定表达 |
| 1.5 HpaXm蛋白的研究进展 |
| 1.6 本研究的目的意义与技术路线 |
| 1.6.1 研究的目的 |
| 1.6.2 研究的意义 |
| 1.6.3 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株、质粒 |
| 2.1.3 试剂配制 |
| 2.2 橡胶白粉菌疑似内源启动子WY172的功能验证 |
| 2.2.1 橡胶白粉菌疑似内源启动子WY172 的克隆 |
| 2.2.2 橡胶白粉菌疑似内源启动子WY172 的载体构建 |
| 2.2.3 橡胶白粉菌疑似内源启动子WY172 的活性检测 |
| 2.3 WY172 驱动外源功能基因HpaXm在烟草中的稳定表达 |
| 2.3.1 植物表达载体pBI121-172-HpaXm的构建 |
| 2.3.2 转基因烟草的获得 |
| 2.3.3 T1 代转基因烟草的微过敏反应测试和TMV抗性分析 |
| 2.4 WY172 启动子类型分析 |
| 2.4.1 WY172 转基因烟草的获得及GUS染色 |
| 2.4.2 WY172 诱导类型分析 |
| 2.4.3 GUS染色 |
| 2.5 渐变缺失突变分析WY172 不同长度片段表达活性 |
| 2.5.1 生物信息学分析 |
| 2.5.2 WY172 启动子不同长度片段的克隆 |
| 2.5.3 WY172 启动子不同长度片段瞬时表达载体的构建 |
| 2.5.4 三亲杂交法转化农杆菌菌株 |
| 2.5.5 GUS染色 |
| 2.5.6 GUS酶活性测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 橡胶树白粉菌疑似启动子WY172 的克隆及功能鉴定 |
| 3.1.1 橡胶白粉菌疑似内源启动子WY172 的载体构建 |
| 3.1.2 橡胶白粉菌疑似内源启动子WY172 的功能验证 |
| 3.2 WY172 驱动HpaXm基因在烟草中的稳定表达 |
| 3.2.1 植物表达载体pBI121-172-HpaXm的构建及转基因烟草的获得 |
| 3.2.2 T1 代转基因烟草m HR分析 |
| 3.2.3 T1 代转基因烟草TMV抗性分析 |
| 3.3 WY172 启动子类型分析 |
| 3.3.1 顺式作用元件分析 |
| 3.3.2 WY172 启动子类型分析 |
| 3.4 渐变缺失突变分析WY172 不同长度片段表达活性 |
| 3.4.1 橡胶白粉菌疑似内源启动子WY172 的生物信息学分析 |
| 3.4.2 WY172 启动子不同长度片段的克隆 |
| 3.4.3 WY172 启动子不同长度片段瞬时表达载体的构建 |
| 3.4.4 GUS染色 |
| 3.4.5 GUS酶活性测定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 启动子的功能验证 |
| 4.2 启动子的类型分析 |
| 4.3 启动子上游序列的活性分析 |
| 5 结论 |
| 5.1 本研究主要结论 |
| 5.2 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、GUS基因分泌型植物表达载体的构建及对烟草的转化（论文参考文献）
- [1]芸薹属基本种扩展蛋白基因家族的进化分析及花粉发育相关扩展蛋白基因的功能分化研究[D]. 刘维妙. 浙江大学, 2021(01)
- [2]马尾松GPPS基因及其启动子功能分析[D]. 陈妤. 南京林业大学, 2021
- [3]棉花腺体形成相关基因GhERF105的功能分析[D]. 吴朝峰. 华中农业大学, 2020(05)
- [4]桑树（Morus alba）三个干旱诱导基因的表达规律及MaCDSP32基因的功能分析[D]. 孙红梅. 西北农林科技大学, 2020
- [5]融合基因4CL1-CCR对烟草细胞壁影响的研究[D]. 胡嘉祺. 北京林业大学, 2020(01)
- [6]依赖R2R3 MYB的生长素信号转导通路调控番茄表皮毛形成[D]. 苑瑜瑾. 重庆大学, 2020(02)
- [7]大豆GmCBL4基因启动子和GmCBL10基因的克隆及遗传转化[D]. 张静. 哈尔滨师范大学, 2020(01)
- [8]大豆GmRIQ2基因上游启动子克隆及其功能分析[D]. 邓晶. 东北农业大学, 2020(04)
- [9]烟草硝酸还原酶基因NIA启动子的克隆及其互作蛋白的筛选[D]. 周炎. 河南农业大学, 2020(06)
- [10]橡胶树白粉菌启动子WY172的克隆、功能鉴定及其对HpaXm的调控分析[D]. 殷金瑶. 海南大学, 2020