一、由生物肝细胞构成的人工肝临床应用的伦理学体会（论文文献综述）
郭伟,卢姗,范红,李君[1]（2020）在《肝衰竭修复替代治疗的现状与发展对策》文中指出背景:为解决肝移植的临床应用受供肝来源短缺限制的问题,世界各国科学家正在积极探索,相继研究发展了人工肝、组织工程肝脏、异种器官移植等技术手段以期解决缓解器官短缺的问题,从而对肝衰竭起到一个修复或替代的治疗作用。目的:阐述肝衰竭修复替代治疗的发展历程、研究现状和未来预期。方法:检索web of science、万方数据库2000至2019年发表的文献,检索关键词为"artificial liver,liver tissue engineering,hepatic failure,肝衰竭,肝移植"。结果与结论:针对肝衰竭等晚期肝脏疾病,主要有原位肝移植、细胞移植、人工肝系统和组织工程肝脏等修复替代治疗手段。国内目前已有多家医院和机构自主研发了人工肝装置,尽管生物型人工肝和混合型人工肝在肝衰竭治疗上展现出很好的发展前景,但大多仍处于动物实验阶段,未来应加大生物反应器的研发力度,增强支架内的细胞活率。利用生物材料和种子细胞构建的组织工程肝脏可以在一定程度上模拟肝脏的合成、解毒、代谢和分泌等生理性功能,可经体内移植治疗终末期肝病,是组织功能领域的研究热点,而解决生物支架体内移植的凝血问题、促进支架的血管化形成是该领域的需要努力的方向。异种移植是解决人类器官供体严重短缺的最佳途径,但该技术距离临床应用依然还有很长的路要走。
刘明颖[2]（2018）在《海藻酸钙微纤维中包封的骨髓间充质干细胞被诱导向血管内皮分化的研究》文中进行了进一步梳理人工构建生物性血管在组织器官工程与血管替代治疗、血管发育与生理病理等领域中展露其重要价值。将血管细胞贴附于一定表面或者将其包封于基质环境中并促使其向“血管”组织形态生长,是构建生物性血管的一类技术策略。但是这类技术策略,在朝向构建微小型血管时面临一些挑战。其主要问题在于用于人工血管构建的生物材料往往不能兼具良好的机械性能和生物相容性,植入体内通常会导致内膜增生进而形成血栓,甚至引起假性动脉瘤。而目前文献中用来构建管状材料的方法较多采用静电纺丝法和相转化法等,其加工过程需要高压或者高温的相对复杂的设备装置,常常引起生物材料的变性,同时也难于直接在加工中引入细胞;而细胞片技术（cell sheet technology,CST）虽然可直接采用成熟的血管细胞（如血管内皮细胞,vascular endothelial cells,VECs）,但是成熟血管的细胞获取较为困难,而且分裂能力十分有限,往往不能形成完整整合的内皮层。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的体外多向分化、跨分化与免疫调控能力,尤其是抗血栓潜力,引起了人工血管研究界的关注,值得把它作为人工构建血管中的主要种子细胞作出系统探索。本论文利用微流控微纤维生成中包封细胞的技术途径,来探索微尺度流控空间约束条件下调控间充质干细胞向血管内皮分化的可能性。首先,将海藻酸钠和氯化钙溶液引入有机玻璃微流控装置实现交联反应,制备出具有良好生物相容性和力学性能的海藻酸钙微纤维;进一步在海藻酸钙微纤维的微流控生成过程中,将MSCs联合血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）和成纤维细胞生长因子（fibroblastic growth factor,FGF）一并包封入微纤维,建立起藻酸钙微纤维流控包封MSCs三维立体培养体系,以此为基础探讨促使其向微血管内皮形态分化的若干分子机制;继而将微纤维-细胞复合体移植入动物体内,评估微纤维-细胞复合体对机体的急性毒性。本文的主要工作和研究结果如下:（1）海藻酸盐微纤维的微流控合成首先自制T型微流控聚焦流装置,其中在结构上利用拉锥毛细管尖端直径的精确截取,以及在加工有T型交叉结构通道装置内的合理置放,使这种流控装置具有生成可控直径的聚焦流能力。在这种聚焦流微流控装置的拉锥毛细管段入口引入海藻酸钠溶液（作为核心流）,侧向通道中引入氯化钙（鞘流）,在一定的流量比范围内,可在装置的出口连续生成不同直径的海藻酸钙凝胶微纤维。检测结果显示所合成的长0.3m-0.5m直径<600?m的海藻酸钙微纤维形态较均匀,内部纹理清晰,表面富有微孔。微纤维的直径与核心流的流量呈线性正相关关系,随核心流流量的增加而增加。直径为500?m和300?m左右的具有类似于以其他人工聚合物为材料的人工血管的缝合强度。（2）MSCs在微纤维中的生长、增殖及血管内皮定向分化将MSCs联合细胞生长因子VEGF和FGF包封入微纤维中进行三维培养,利用DiO活细胞染色,Live/dead细胞染色和CCK-8法观察海藻酸盐微纤维中三维培养中MSCs生长增殖情况,并用Elisa法检测VEGF从海藻酸盐微纤维中的释放特性;进一步利用免疫荧光化学,RT-PCR,Western blot和流式细胞等技术,观察VEGF和FGF在藻酸盐微纤维包封培养中对MSCs向VECs诱导分化的影响。结果显示,细胞生长因子VEGF和FGF在藻酸盐微纤维中能促进MSCs增殖并维持其活力,且双细胞生长因子的协同作用下对MSCs增殖的促进更为明显。MSCs的增殖主要集中在一周之内,两周左右MSCs趋于成团生长并出现凋亡,其生长周期与二维平板培养无显着差别。海藻酸盐微纤维具有良好的生化物质承载性能、缓释性能以及细胞包封率,包封的MSCs在微纤维内能够连续分泌VEGF并通过微纤维释放。这些结果表明,VEGF和FGF在藻酸盐微纤维中能够诱导MSCs定向分化为VECs。（3）海藻酸盐微纤维-细胞复合物急性毒性的评估将海藻酸盐微纤维-细胞复合物腹腔移植入小鼠体内利用组织病理学定性评估移植物的心血管系统急性毒性。结果显示海藻酸盐微纤维-细胞复合物对于生物机体无明显毒性,具有较好的生物相容性和良好的抗血栓潜能。综合上述结果,本文利用微流控方法制备的海藻酸盐微纤维具有良好生物物理性和生物相容性,细胞因子VEGF和FGF能够在微纤维中促进MSCs的生长增殖以及内皮分化,同时微纤维-细胞复合体对机体无急性毒性,这表明这种体系有利于人工血管的初步构建。本研究为人工血管的合成以及后续血管疾病的治疗预示了新的可行性。
高崇勇[3]（2017）在《HBV相关慢加急性肝衰竭中医证型分布规律及影响因素》文中研究指明目的研究HBV相关慢加急性肝衰竭患者中医证型分布规律,性别、年龄、病程及实验室指标与中医证型分布的关系,以及证型与疾病预后的关系。方法通过回顾性研究,收集成都中医药大学附属医院2013年1月至2017年1月诊断为“HBV相关慢加急性肝衰竭”住院患者病例,每例病例按标准化病例调查表进行登记,建立数据库,探索HBV相关慢加急性肝衰竭的中医证型分布特点,性别、年龄、病程及实验室指标与中医证型分布的关系,以及证型与疾病预后的关系。结果⑴、HBV相关慢加急性肝衰竭男性发病率高于女性,男女比例为3.56:1;发病平均年龄45.07±13.11岁,以中青年居多,占92.23%%;职业以农民、工人最多;肝病病程10-19年和20-29年居多,共占76.19%;已知发病诱因中的以熬夜劳累、抗病毒相关因素为多,共占45.71%。⑵、105例HBV相关慢加急性肝衰竭患者中HBeAg阳性占56.19%,HBV-DNA阳性占65.71%;HBV相关慢加急性肝衰竭患者发生并发症及合并症较多,以低蛋白血症（96.19%）、腹水（62.85%）、电解质紊乱（61.90%）、肝性脑病（42.85%）、肝肾综合征（26.66%）为主。⑶、中医证型分布为湿热发黄证39.04%;阳虚瘀黄证占27.62%;寒湿发黄证26.67%;疫毒发黄证1.91%;气虚瘀黄证占2.85%;阴虚瘀黄证占1.91%;性别、并发症与在各中医证型间的差异,无统计学意义（P>0.05）。年龄段、病程,疾病分期与各中医证型间的差异,有统计学意义（P<0.05）。⑷、实验室指标在各中医证型间的差异:HBe Ag、ALT、AST在各中医证型间的差异,无统计学意义（P>0.05）;HBV-DNA、PTA、TBIL、DBIL在各中医证型间的差异,有统计学意义（P<0.05）。⑸、各中医证型在疾病预后的差异,有统计学意义（P<0.05）,其中,湿热发黄证疾病好转率高于其他证型;阳虚瘀黄证疾病死亡率高于其他证型。结论:1、HBV相关慢加急性肝衰竭发病人群特点:男性发病率高于女性,以中青年为主,职业多为工人及农民,疾病病程长,熬夜劳累、抗病毒治疗相关因素为重要的已知诱因;2、HBV相关慢加急性肝衰竭并发症及合并症较多;3、性别,并发症及合并症,HBeAg,ALT、AST对中医证型分布无影响;4、年龄段,病程,疾病分期（早期及晚期）,HBV-DNA,PTA,TBIL、DBIL对中医证型分布具有一定影响;5、湿热发黄证疾病好转率较其他证型更高,阳虚瘀黄证死亡率较其他证型更高,提示中医证型可能与疾病预后存在一定关系
蔡磊[4]（2017）在《基于微囊化猪肝细胞的生物人工肝治疗食蟹猴急性肝衰竭的实验研究》文中提出第一章食蟹猴急性肝功能衰竭模型的建立及评价目的:稳定的、重复性好的大动物急性肝衰竭（ALF）模型是人工肝研究不可或缺的平台。本章研究旨在建立一种药物和外科食蟹猴ALF模型。方法:1、16只食蟹猴随机分为4组（A,B,C,D）,分别经外周静脉注射0.30,0.25,0.20 + 0.05（间隔 24 h）,0.20 g/kg 的 D-氨基半乳糖（D-gal）;给药后观察受试猴的临床表现,生存时间,生化、凝血、颅内压（ICP）和肝脏的病理变化;2、6只食蟹猴行袖套式插管门静脉-右肾静脉转流联合胆总管结扎、切断术（PRRS+CBDLT）,术后观察动物的临床表现,生化、凝血和肝脏的病理和组织学变化。结果:1、给药后受试猴均出现不同程度的精神萎靡,进食减少、黄疽等表现,生存时间ABC三组分别为56±8.7h、95±5.5h和99±2.2h,D组除1只136h死亡外,其余猴全部存活。血清肝酶、TBiL、Cr、BUN、血Amm等明显升高,ALB水平降低,PT明显延长,ICP增高等,病理学鉴定有明显肝细胞片状坏死、伴出血。2、术后实验猴血清AST、ALT、CK、LDH、ALP、TBiL、DBiL等明显升高,PT明显延长,ALB水平降低,术后第10天肝标本病理学和组织学检测出明显的肝细胞坏死、变性、凋亡等炎症反应。结论:成功构建了 D-gal诱导的药物性食蟹猴ALF模型和PRRS + CBDLT诱导的简化外科食蟹猴ALF模型。第二章基于微囊化猪肝细胞的生物人工肝安全性及有效性的评估目的:以具有自主知识产权的往返翻转灌注型生物反应器为核心,装载微囊化的猪肝细胞,组建生物人工肝（BAL）,通过对食蟹猴ALF模型的救治实验对其安全性和有效性进行评价,为其进一步临床试验奠定基础。方法:采用D-gal分次诱导建立食蟹猴药物性ALF模型,离体胶原酶两步灌流法分离西藏小型猪原代肝细胞,制备海藻酸钠-聚赖氨酸（APA）裹肝细胞微囊,装入往返翻转灌注型生物反应器中,构建BAL,用于ALF食蟹猴的治疗。15只ALF食蟹猴随机分为三组:（1）ALF组（空白对照）:模型猴仅观察不治疗;（2）BAL组:模型猴接受装载微囊化猪肝细胞的BAL治疗;（3）Sham组（设备对照）:模型猴接入BAL系统体外循环6小时,反应器内装载不含细胞的APA空微囊。比较三组实验猴治疗前后的生存时间、生化指标、PT及ICP等变化。结果:治疗过程中实验猴均耐受良好。与两个对照组相比,BAL组受试猴生存时间分别延长14小时、16小时。BAL可以显着降低受试猴血清肝酶、TBiL、血Amm等浓度和ICP,具有明显的肝支持作用。结论:基于微囊化猪肝细胞的生物人工肝系统能够改善ALF食蟹猴的血生化指标和ICP,延长生存时间。
季茹[5]（2013）在《肝脏脱细胞生物支架的制备及诱导骨髓间充质干细胞肝向分化的研究》文中研究说明肝移植是目前针对终末期肝病的有效治疗方式。然而，供肝短缺、手术并发症、慢性排斥反应和医疗成本高等限制因素迫使研究者开始寻求新的替代治疗，并诞生了肝脏组织工程和再生医学这一新兴研究领域。在过去的数十年中，尽管研究人员在仿生三维动态培养方面取得了较大进展，但仍难于完全模仿肝脏细胞外基质（ECM）的复杂微环境。目前，全器官脱细胞支架正逐渐受到研究者的关注。脱细胞是指去除脏器中细胞成分，并且最大程度地保留脏器的大体形态、ECM成分和超微结构。一些研究成功地将功能性实质细胞或特定干/祖细胞种植于脱细胞ECM，为组织工程和再生医学研究提供新的研究平台。脱细胞支架研究的一个难题是脱细胞方案的选择和优化。近年来，研究人员已通过比较研究对心脏、肾脏、肺和膀胱等器官的脱细胞方案进行了改进。目前，文献中已报道了多种方案制备脱细胞肝支架（DLB），但尚无研究对上述方案制备DLB的理化性质、细胞相容性和免疫原性进行比较。该研究领域的另一难题是如何获取足够数量且功能完备的肝细胞。由于自体肝组织获取和体外维持肝细胞特性等方面存在困难，从干/祖细胞获取肝细胞成为目前该领域关注的研究热点。其中，间充质干细胞（MSCs）被认为是最具治疗潜力的细胞类型之一。目前已有多项研究证实了MSCs在特定培养条件下可诱导分化为类肝细胞。但诱导成功率较低，并且诱导的类肝细胞只具有成熟肝细胞的部分标志物和功能。因此，对MSCs肝向分化诱导方案和培养条件还需要进一步研究。近期一些研究证实组织特异性ECM可促进干/祖细胞定向分化。本研究将探讨DLB是否能够体外诱导MSCs向肝系细胞分化。本研究利用三种文献报道的洗脱方案（CHAPS、SDS和Triton X-100方案）和一种新建立的方案（NP-40方案）制备大鼠DLB，全面评估DLB的结构特点和生化特性及其细胞相容性和免疫原性，为DLB制备方案的改进提供依据；本课题还利用大鼠DLB制成的三维支架，为小鼠MSCs提供体外培养和诱导分化微环境，为体外高效诱导MSCs向肝系细胞分化寻找新的方法；最后，将体外预分化的MSCs移植给CCl4致肝纤维化小鼠，进一步观察DLB体外诱导分化MSCs的在体功能，并对其治疗作用机制进行探讨。主要研究成果如下：1.除CHAPS方案外，SDS、Triton X-100和NP-40方案均成功制备出符合脱细胞标准的大鼠DLB，但不同方案制备的DLB在超微结构、ECM成分、细胞相容性和免疫原性存在明显差异；与SDS和Triton X-100方案相比，NP-40方案制备的DLB具有更好的细胞支持作用和体内重塑结局；另外，统计学分析发现DLB体内重塑结局与DNA残留量、M2巨噬细胞数量和M2:M1细胞比值具有显着相关性。2.从GFP基因敲入C57BL/6小鼠体内成功分离和培养出骨髓干细胞，表达MSCs的细胞形态和表面标志物；NP-40制备的DLB为种植的MSCs提供了三维生长微环境；与DLB和培养瓶（TCF）静止培养相比，动态培养的DLB显着提高MSCs的细胞存活率和增殖速度。3.动态培养肝支架（DCS）本身或联合肝细胞诱导生长因子（GF），均能体外诱导MSCs向肝系细胞分化；与TCF培养相比，DCS培养的细胞表达更高水平的肝细胞标志物（AFP、ALB、CK7、CK8、CK9、CK19、肝细胞转录因子和肝细胞代谢酶等），并具有更强的肝细胞相关合成和代谢功能（分泌AFP和ALB、代谢尿素、合成糖原、摄取吲哚氰绿和低密度脂蛋白），以及具有成熟肝细胞超微结构特点。4.与未分化MSCs相比，体外利用GF预处理或DCS联合GF预处理的MSCs在移植给CCl4致肝纤维化小鼠后显着改善小鼠生存率、肝脏功能和纤维化程度；其中DCS联合GF预处理MSCs的归巢效率最高。定植到肝脏的预分化MSCs主要通过旁分泌作用抑制肝星状细胞活化、刺激内源性肝细胞增殖，达到修复肝损伤的目的。上述结果表明，本研究建立了一种新的肝脏脱细胞方案，制备的DLB具有良好的细胞相容性和较低的免疫原性；这种DLB在动态培养条件下可以高效地诱导MSCs向类肝细胞分化、表达更加稳定和丰富的肝细胞功能，并在移植体内后对慢性肝损伤具有较好的治疗作用。总之，这种肝脏脱细胞支架为肝脏组织工程和再生医学提供了一个全新的研究平台，有望为临床治疗终末期肝病提供新的治疗手段。
吴青松[6]（2012）在《人端粒酶逆转录酶与Caspase-3 si-RNA构建永生化人肝细胞株》文中研究表明研究背景各种原因所致的肝功能衰竭严重威胁着人类健康,原位肝移植由于费用昂贵、供体短缺限制其在临床的应用。生物人工肝支持系统借助体外装置暂时替代肝脏功能,直至自体肝脏功能恢复或进行肝移植,是目前肝衰竭治疗研究的热点之一。肝细胞是生物人工肝支持系统的核心部分,从生物工程学角度讲,用于生物人工肝的理想肝细胞要人源性、表型正常,容易获得和培养,能在体外迅速生长增殖至高密度,保持良好的分化状态,具有成熟肝细胞的所有生物代谢功能。由于人原代肝细胞存在体外培养条件苛刻、存活时间有限、增殖传代困难及来源短缺等问题,因此,构建一个增殖能力强且具备良好分化功能的人肝细胞系对生物人工肝的发展是至关重要的。人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase, hTERT）的激活是细胞永生化的重要步骤。通过转入外源性基因hTERT到端粒酶阴性细胞中可以恢复目的细胞端粒酶的活性,使细胞的端粒长度得到修复和保持,进而延长细胞在体外培养条件下的寿命,甚至发展为永生化。Caspase-3是哺乳动物细胞凋亡中的关键蛋白酶,处于凋亡级联反应通路的核心位置,是细胞凋亡蛋白级联反应的必经之路。借助siRNA技术手段沉默Caspase-3的表达,有可能通过慢病毒载体转染人原代肝细胞,所构建的永生化人肝细胞在基因组的保真性和稳定性、细胞的合成代谢功能方面均具有较好的优势。本研究采用细胞永生化和抗调亡原理,应用基因克隆、RNAi干扰、慢病毒表达载体等技术构建hTERT基因与Caspase-3RNAi两个慢病毒载体,利用慢病毒表达载体对原代培养的正常人肝细胞稳定转染人端粒酶逆转录酶基因和抑制Caspase-3表达的siRNA,建立永生化人肝细胞株HepGL,并对其生物学特性及某些功能进行研究,评价其作为生物人工肝种子细胞的可行性。全文共分五章：第一章慢病毒载体pLENT6.3/V5-hTERT-IRES-RFP的构建目的：利用慢病毒载体构建携带有目的基因人端粒酶逆转录酶（hTERT）和标记基因红色荧光蛋白（RFP）的真核表达载体pLENT6.3/V5-htert-IRES-RFP,为基因转染人原代肝细胞奠定实验基础。方法：①慢病毒phTERT-IRES-RFP的构建和鉴定：PCR扩增hTERT基因并克隆入pIRES-RFP载体,通过BglⅡ和EcoRI酶切,克隆入pIRES-RFP载体的BglⅡ和EcoRI位点之间。PCR产物经纯化、酶切后胶回收,以质粒pIRES-RFP为模板,通过载体酶切,T4-DNA连接酶反应。将连接产物转化大肠杆菌DH5a,卡那霉素筛选,挑取阳性克隆行PCR、酶切及测序验证phTERT-IRES-RFP质粒。②pLENT6.3/V5-htert-IRES-RFP重组载体的构建和鉴定：PCR扩增hTERT-IRES-RFP片段并克隆入pLenti6.3-MCS-V5慢病毒载体,通过用BglⅡ和Nhel酶切,克隆入pLenti6.3-MCS-V5载体的BamHI和NheⅠ位点之间。PCR产物经纯化、酶切后胶回收,以pLenti6.3-MCS-V5慢病毒载体为模板,通过载体酶切,T4-DNA连接酶反应。将连接产物转化入大肠杆菌STB13感受态,挑取单菌落扩增培养,提取质粒,并进行测序证实pLENT6.3/V5-htert-IRES-RFP载体。③含hTERT-RFP病毒颗粒上清的包装和收集：利用脂质体转染法将慢病毒表达载体pLENT6.3/V5-htert-IRES-RFP、包装质粒（含pLP1, pLP2和pLP/VSVG三个质粒）共转染293FT细胞,包装收集病毒,浓缩,滴度测定。结果：①慢病毒phTERT-IRES-RFP的构建和鉴定结果：本实验成功扩增长达约3.4Kbp的hTERT片段,行PCR,酶切及测序鉴定,证实hTERT已克隆入pIRES-RFP载体,并成功获得phTERT-IRES-RFP产物。②LENT6.3/V5-htert-IRES-RFP重组载体的构建和鉴定结果：经PCR扩增hTERT-IRES-RFP片段并克隆入pLenti6.3-MCS-V5慢病毒载体构建得慢病毒重组质粒pLENT6.3/V5-htert-IRES-RFP,将重组质粒测序,证实重组质粒pLENT6.3/V5-htert-IRES-RFP构建成功。③含hTERT-RFP病毒颗粒上清液的制备结果：将pLENT6.3/V5-htert-IRES-RFP与包装质粒共转染293FT细胞,终止转染72h后收集上清液,即得含hTERT-RFP病毒颗粒的上清液。根据滴度计算公式计算得到慢病毒的滴度为5.88x106TU/mL结论：成功利用慢病毒载体构建携带hTERT基因的真核表达载体pLENT6.3/V5-htert-IRES-RFP。第二章Caspase-3siRNA慢病毒载体的构建目的：构建针对目的基因Caspase-3序列表达的RNAi DNA质粒载体,并筛选出有效的干扰靶点并进行慢病毒载体包装。方法：①siRNA干扰载体的构建：针对目的基因caspase-3基因序列,利用公用网站按照RNA干扰序列设计原则,设计4对siRNA干扰靶点序列,分别为SR1SR2SR3、SR4, SRneg （C-）为阴性对照,将4对双链的siRNA oligo分别插入到siRNA表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR中,构建4个siRNA表达质粒,并转化至感受态细胞DH5α。用载体通用引物进行菌落PCR筛选得到的阳性克隆进行测序,验证重组克隆中插入片段序列与设计的oligo序列一致,扩增质粒备用。②iRNA干扰载体的转染与筛选：应用干扰质粒瞬时转染处于对数生长期的HEK293细胞,24h后观察荧光表达情况；运用qPCR和Weatern Blot检测各干扰质粒在基因和蛋白水平对目的蛋白的抑制水平。根据qPCR的结果,pcDNATM6.2-GW/EmGFPmi-SR2瞬时转染后,对目的基因的抑制效果最为明显。③慢病毒表达载体构建、包装：应用Gateway重组技术构建慢病毒表达载体pLENT6.3/V5-SR2。经过比对,重组的慢病毒载体中oligo序列完全正确。慢病毒载体的构建成功,扩增质粒备用；利用慢病毒包装细胞293FT细胞,包装病毒,测定滴度。所得实验数据用均数±标准差（x±SD）表示,取检验性显着水准a=0.05,用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,采用One-Way ANOVA对实时荧光定量RT-PCR结果进行单因素方差分析,样本方差齐性时选用LSD法进行组间多重比较,方差不齐时则选用Tamhane’s T2法进行比较。结果：①设计4个干扰靶点,分别为分别为SR1、SR2、SR3、SR4, SRneg（C-）为阴性对照,并与siRNA表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR成功连接,构建4个siRNA表达质粒质粒成功连接；②经过测序对比,构建的4个针对caspase-3的RNAi质粒载体成功,并成功扩增和抽提；③经过qPCR检测,单因素方差分析显示,4个siRNA转染显着地影响了HEK293细胞中Caspase-3表达(Welch=27965.102,组间多重比较（Tamhane’s T2法）结果显示：siRNA2转染HEK293细胞后Caspase-3mRNA相对表达量为（9.84±0.461,P<0.001）,对目的基因的抑制效果最为明显。④使用Gateway重组技术构建慢病毒表达载体pLENT6.3/V5-SR2检测测序序列完全正确,慢病毒载体的构建成功。⑤慢病毒的经包装后滴度测定为3.6x105TU/ml。结论：成功构建针对Caspase-3基因的siRNA慢病毒载体。第三章人原代肝细胞分离培养目的：建立人原代肝细胞体外分离方法。方法：采用多点穿刺灌注的方法,将预温38℃的前灌流液以及Ⅱ型胶原酶溶液灌注入人肝脏组织中,经过消化及离心后获得人原代肝细胞；倒置显微镜和电镜观察细胞形态特征,并进行鉴定：台盼蓝及吖啶橙／碘化丙啶染色鉴定细胞活力,PAS （periodicacid-Schiff, PAS）染色观察细胞肝糖元的含量,免疫细胞化学鉴定肝细胞ALB表达。结果：平均大小为3cm×2cm×1cm的肝组织块经多点穿刺灌注法消化分离后,可获得约5×105个肝细胞,分离获得的细胞活率达90%；细胞培养24小时后呈铺路石样生长,无增殖现象,电镜示肝细胞呈典型的细胞核大,胞质少；培养的肝细胞PAS糖原染色阳性；ALB表达阳性。结论：多点穿刺灌注法分离人原代肝细胞,方法简单易行,且肝细胞产量高、活力好、纯度高,培养的肝细胞具有特异性生物学功能表达,适宜在一般条件实验室推广应用。第四章永生化人肝细胞株的建立及鉴定目的：研究慢病毒介导人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因和Caspase-3siRNA异时先后转染人原代肝细胞构建永生化人肝细胞株HepGL并进行形态和功能学鉴定。方法：将表达h-TERT基因的重组慢病毒感染人原代肝细胞,通过杀稻瘟筛选获得阳性克隆,获得HepGL-H肝细胞；用含Caspase-3-siRNA的慢病毒液感染HepGL-H细胞构建永生化人肝细胞HepGL,并分别通过倒置相差显微镜动态观察转染前后肝细胞形态变化及生长增殖情况；PAS （peri odicacid-Schiff, PAS）染色观察细胞肝糖元的含量,免疫细胞化学鉴定肝细胞ALB表达。分析其染色体核型;RT-PCR测定其相关功能基因和表面标志基因表达；通过全自动生化分析仪测定HepGL细胞培养上清中ALT.AST.尿素浓度变化；绘制HepGL细胞生长曲线。结果：所建立的永生化人肝细胞株HepGL具有原代肝细胞的典型形态特征,而且具有较好的增殖能力,染色体核型分析表明细胞核型无明显异常；RT-PCR检测HepGL表达hTERT.P4503A.albumin.ASGPR.GS.GST-π兀.HBCF-X.HNF4. CK18mRNA的肝细胞生物学特性；全自动生化分析仪测定HepGL细胞培养上清中ALT、AST浓度随着培养时间的延长呈递减趋势,尿素则呈逐渐递增趋势。结论：本研究建立的永生化人肝细胞株HepGL具有与原代肝细胞类似的形态特征和生物学功能,可以成为生物人工肝及肝细胞移植研究中理想的种子细胞材料。第五章永生化人肝细胞株的安全性研究目的：探讨永生化人肝细胞株HepGL有无致瘤性。方法：实验分为HepGL组和C3A组两组,按随机数目表法完全随机分配,每组裸鼠10只。两组分别在裸鼠的颈部、后背部皮下以0.2ml,2.0×106个HepGL和C3A细胞,观察皮下组织致瘤情况。每天测量瘤体大小,5周后切取注射部位瘤组织及脑、肝、肺、肾组织标本。结果：HepGL组未见接种部位出现种植瘤,组织学观察表明接种区组织结构与未接种部位无明显区别,肝、肺、脑、肾组织切片无转移。C3A组共有20个接种部位出现肿瘤,致瘤率为100%,裸鼠皮下种植瘤细胞形态大小均一,细胞核深染,核分裂相较多,细胞呈梁状排列。结论：永生化人肝细胞株HepGL无致瘤性,具备良好的应用安全性。
洪文艺[7]（2011）在《生态饭店的理论构想及实现途径研究》文中进行了进一步梳理在世界饭店业迅猛发展的浪潮之下,有两大问题困扰着我国饭店业的未来发展：①饭店业给环境带来的压力越来越大；②饭店业的未来发展缺乏先进理论的支撑。事实上,从20世纪80年代末开始,饭店与环境的协调问题一直被世界饭店业所关注；饭店业也在不断地寻找着新的支撑理论。在此过程中先后出现的环保饭店、节约饭店、绿色饭店、循环饭店、低碳饭店等,就是在解决上述问题中进行的有益探索。然而,近30年的实践证明,“绿色饭店”所依托的主体理论越来越表现出局限与不足；“循环饭店”的成功离不开国家层面强大的循环体系的支撑；“低碳饭店”的发展则离不开国家和国际层面的“碳”交易平台的支撑。因此,在现有条件之下,中国饭店业要想“突出重围”,必须走“生态饭店”之路。论文以生态学和现代饭店管理学理论为指导,对生态饭店的理论构建和实现途径进行研究,取得以下主要成果：（1）从饭店的产品、行业、功能、管理等饭店的属性变化,分析了中国饭店从业态形式到产品内涵的深刻变化,并通过饭店的本质属性、主体、功能、组成结构及特征的分析,对饭店的概念进行了再定义,即饭店是为人们提供住宿及相关环境和服务的公共系统。（2）从生态系统角度分析了饭店生态系统的组成、结构和功能,提出饭店是一个典型的人工复合生态系统,具有人本性、复合性、消费性、污染性、依赖性、开放性和高度敏感性的特征,其中,消费（消耗）是饭店系统的生态本质。（3）通过对饭店自然、环境与生态问题的辨析,提出饭店生态系统中所有影响到饭店、人、环境三者之间的稳定平衡、互惠共生的和谐关系问题都是饭店生态问题。饭店系统的生态问题具体表现在：饭店自身、饭店对人、人对饭店、饭店对环境和环境对饭店等5个方面的生态问题。（4）基于绿色饭店的分析,重新修订了生态饭店的概念,即生态饭店是一个基于生态学原理,在全面协调饭店、人、环境三者之间互惠共生、稳定平衡的基础上,实现经济高效、安全健康、环境友好、社会和谐四大本质功能而建立的人工复合生态系统。（5）探讨了生态饭店的组成、结构、功能和特征,指出人、饭店、环境三大因子共同组成了生态饭店的三元结构；普通饭店、环保饭店、绿色饭店、循环饭店、低碳饭店、生态饭店逐步递进的五个层次构成了生态饭店的金字塔结构；经济高效运行、安全健康舒适、环境友好持续和社会和谐稳定是生态饭店的四大功能；自然、经济和文化特征是生态饭店的本质特征；生态伦理的哲学思想和自然道德是协调饭店生态系统中人、饭店、环境三者之间的生态关系的道德准则。（6）提出了生态饭店实现途径的三要素：生态设计、系统管理和社会支撑,其中生态设计是关键,它解决的是生态饭店的结构合理、功能优化的问题；系统管理是基础,它解决的是生态饭店的系统功能是否能够正常发挥的问题；社会支撑是保障,它解决的是各种环境为生态饭店的稳定运行提供保障的问题。（7）以江西景德镇紫晶宾馆为案例,通过对宾馆室内外环境质量的检测,分析了紫晶宾馆的生态优势和生态问题；建立了生态饭店的评价指标体系和生态饭店等级划分导向,评价结果表明紫晶宾馆属于EEE级（中级）生态宾馆；最后从硬件和软件两个方面提出了紫晶宾馆达到更高等级的生态宾馆的实现途径。本研究的主要创新点：（1）对饭店和生态饭店进行了再定义,饭店是为人们提供住宿及相关环境和服务的公共系统；生态饭店是一个基于生态学原理,在全面协调饭店、人、环境三者之间互惠共生、稳定平衡的基础上,实现经济高效、安全健康、环境友好、社会和谐四大本质功能而建立的人工复合生态系统。（2）初步建立了生态饭店的理论体系,从生态饭店的组成、结构、功能角度提出“人、饭店、环境”的三元结构,“普通饭店、环保饭店、绿色饭店、循环饭店、低碳饭店、生态饭店”的金字塔结构,“经济高效运行、安全健康舒适、环境友好持续和社会和谐稳定”的四大功能。生态饭店具有自然、经济和文化的综合特征,而生态伦理的哲学思想和自然道德是协调生态饭店中人、饭店、环境三者之间的生态关系的道德准则。（3）提出了生态设计、系统管理和社会支撑是实现生态饭店三条途径,生态设计可解决生态饭店的结构合理、功能优化,系统管理能满足生态饭店系统功能的正常发挥,社会支撑是维持生态饭店的稳定运行。（4）探索性地构建了生态饭店评价指标体系和等级划分导向,并以景德镇紫晶宾馆为例进行了实证研究,为我国饭店的生态化建设提供了借鉴。总之,本研究通过对国内外该领域研究的理论总结,运用生态学和现代饭店管理理论对生态饭店的理论体系和实现途径进行了研究,建立了一套生态饭店的理论体系与方法,研究成果将对我国生态饭店建设起到促进作用。
张国寿[8]（2011）在《酵母双杂交筛选与TCTP相互作用的蛋白及其功能的研究》文中研究指明目的利用酵母双杂交系统筛选与受翻译调节的肿瘤蛋白（TCTP）相互作用的肝细胞蛋白,探讨TCTP在肝细胞癌发病机制中的作用,为肝脏疾病的研究及治疗提供新的思路和视角。方法采用Western-blot实验对TCTP在肝癌组织高表达和癌旁组织低表达的表达情况进行验证,从新鲜的肝癌组织提取mRNA,扩增TCTP基因,构建酵母双杂交诱饵质粒pDEST32-TCTP,对重组质粒酶切鉴定及序列测定,Western-blot检测TCTP在酵母中表达,在不同的缺陷培养基上培养酵母细胞,以验证系统的稳定性,在3AT浓度梯度培养皿中观察其生长的结果确定抑制自激活3AT的浓度,经BP、LR反应构建肝cDNA文库的猎物质粒;进行TCTP酵母双杂交文库筛选,对阳性克隆质粒测序和生物学分析;免疫共沉淀验证TCTP与细胞S期激酶相关蛋白-2（Skp2）和卵泡抑素（FS）两个候选蛋白在细胞内的相互作用,GST pull-down验证TCTP与Skp2和FS两个候选蛋白的相互作用;Western-blot实验对TCTP蛋白与Skp2蛋白相互作用促进下游p27蛋白的降解进行检测,通过软琼脂实验和MTT实验检测TCTP蛋白促进肝癌细胞的增殖。结果TCTP在肝癌组织高表达和癌旁组织低表达得到验证,成功构建酵母双杂交诱饵质粒pDEST32-TCTP,利用肝cDNA文库构建好猎物质粒,酵母双杂交系统稳定可靠,且不会产生自激活,适合文库筛选;酵母双杂交文库筛选出21个阳性克隆质粒,对阳性克隆测序和生物学分析,其中6个为已知蛋白基因:Smad4、HSP60、TAKl、Bcl-xl、FS、Skp2;TCTP蛋白分别与FS、Skp2蛋白相互作用在免疫共沉淀法和GST pull-down法中得到验证;TCTP与Skp2相互作用促进了Skp2蛋白介导的下游蛋白p27的降解,软琼脂实验和MTT实验显示TCTP蛋白可以促进肝癌细胞的增殖。结论肝细胞中存在TCTP蛋白与FS、Skp2蛋白相互作用,TCTP可能通过蛋白间直接相互作用调节Skp2,增强Skp2蛋白介导的下游蛋白p27的降解,引起细胞周期调控的异常,促进肝癌细胞的增殖,从而实现TCTP在肝细胞癌发病机制中的作用。
郝彦琴[9]（2010）在《骨髓间充质干细胞移植对急性肝衰竭大鼠肠源性内毒素血症的治疗作用及机制研究》文中认为研究背景：急性肝衰竭（acute liver failure, ALF）是一种严重危害人类生命健康的临床综合征,肝移植是目前最有效的治疗肝衰竭的方法,但是,肝移植由于供体短缺及费用昂贵等问题限制了其广泛应用。因此,迫切需要探索新的治疗方法以挽救肝衰竭患者的生命。近年来许多动物及临床研究发现,骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell, BMSC）可以在体内外诱导分化为肝细胞,BMSC移植可以在体内增殖、分化为肝细胞或肝样细胞,替代受损的肝细胞,促进肝功能恢复,因此,有人已将BMSC移植用于治疗ALF并显示出具有显着的疗效。目前,对于BMSC治疗肝衰竭作用机制的研究主要集中在BMSC的分化潜能方面。然而实验研究发现,BMSC在体外诱导分化为肝细胞需要6-12天,体内分化也需要4-5天,而BMSC在移植的早期未分化为肝细胞或肝样细胞时即显示出具有显着的疗效,用干细胞分化机制不足以解释BMSC移植的这种早期应答。那么,BMSC移植早期是通过何种机制发挥作用?有研究提出,BMSC具有抗炎和免疫调节作用,这种作用是否在BMSC移植早期发挥其效应?另外,大量临床研究结果表明,ALF患者伴有的肠源性内毒素血症（Intestinal Endotoxemia, IETM）在肝衰竭的发生发展过程中起重要作用,内毒素可以直接损伤肝细胞,还可以激活下游炎症级联反应,引起大量肝细胞凋亡及坏死,导致肝衰竭。韩德五教授提出了IETM是各种原因导致肝衰竭发生的唯一的共同物质基础,并且这一理论在实验和临床研究中已经得以证实。那么：BMSC对ALF大鼠IETM究竟有何作用?其作用机制如何?是本文的研究重点。本课题首先建立一种简便、快捷的体外分离培养大鼠BMSC的方法,在此基础上观察BMSC移植治疗ALF大鼠的作用,从细胞水平及在体水平探讨其可能的机制,为临床治疗ALF提供新的思路。本研究共分三个部分：第一部分骨髓间充质干细胞的分离培养及其生物学特性的研究第二部分骨髓间充质干细胞移植对急性肝衰竭大鼠肠源性内毒素血症的影响第三部分骨髓间充质干细胞移植对急性肝衰竭大鼠肠源性内毒素血症治疗作用机制的研究第一部分骨髓间充质干细胞的分离培养及其生物学特性的研究目的建立一种简便、快速、有效的体外分离培养大鼠BMSC的方法并进行初步鉴定。方法无菌条件下取大鼠四肢长骨骨髓,在含20%胎牛血清的DMEM/F12中贴壁培养,倒置显微镜下观察细胞的形态变化；采用免疫细胞化学方法检测细胞膜抗原CD34、CD44及CD45的表达；采用流式细胞术检测细胞周期；细胞加成脂诱导剂体外培养14天后,行油红O染色,观察细胞分化结果。结果分离培养的细胞2-3天后呈多形性贴壁生长并开始大量增殖,3代以后的细胞呈均一的成纤维细胞样形态。免疫细胞化学染色显示,细胞表面分子CD44阳性,CD34、CD45阴性。细胞周期检测结果显示,（80.13±1.24）%的第3代BMSC处于G1期。细胞加成脂诱导剂后14天经油红O染色可见胞质内有橙红色的脂滴。结论采用全骨髓贴壁培养法可以方便、快捷地获得BMSC,并且在体外培养条件下能大量增殖,经诱导后可以向脂肪细胞分化,具有干细胞的生物学特性,是一种比较理想的体外培养方法。第二部分骨髓间充质干细胞移植对急性肝衰竭大鼠肠源性内毒素血症的影响实验一急性肝衰竭大鼠伴肠源性内毒素血症模型的建立目的探讨用不同剂量硫代乙酰胺（Thioacetamide, TAA）制作ALF大鼠伴IETM模型的量-效关系。方法设立3个TAA剂量组,每组10只,分别以200、400、600 mg/（kg·d）剂量的TAA灌胃,24h后相同剂量TAA重复灌胃一次,建立不同剂量TAA致大鼠IETM的动物模型,并设立对照组,以等体积0.9%氯化钠溶液灌胃。观察造模后24h、48h大鼠的死亡率,48h后剩余大鼠腹主动脉采血检测血清中丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）及血浆内毒素含量,取部分肝脏及回肠组织作常规HE染色,光镜下观察肝脏及回肠组织的病理变化。结果不同剂量TAA组大鼠在肝损伤评分、ALT、AST、内毒素水平方面与对照组相比差异均有统计学意义（P<0.05）。TAA剂量越大,死亡率越高,肝损评分、ALT、AST及内毒素水平也越高。200mg/kg TAA模型组肝坏死不明显,400mg/kg TAA模型组与600mg/kg TAA模型组有明显肝坏死,ALT、AST及内毒素水平与200mg/kg TAA组相比明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）。不同剂量TAA模型组有不同程度的肠粘膜损伤。结论TAA致肝损伤具有明显的剂量依赖性,其中400 mg/（kg·d）TAA剂量为制备ALF伴IETM模型的适宜剂量。实验二骨髓间充质干细胞移植对急性肝衰竭大鼠内毒素及细胞因子的影响目的探讨BMSC移植对TAA所致ALF大鼠内毒素及TNF-α、IL-10的影响。方法雌性Wistar大鼠30只,体重250±10g,随机分为对照组、TAA模型组和TAA+BMSC治疗组,每组10只。采用TAA 400mg/kg灌胃,24h后重复灌胃建立ALF大鼠模型,对照组给予0.9%氯化钠溶液2m1灌胃；第二次灌胃后将BMSC（1×106个细胞/只）经尾静脉移植到TAA+BMSC治疗组大鼠体内,对照组和TAA模型组大鼠经尾静脉给予等量无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。BMSC治疗72h后将大鼠麻醉状态下腹主动脉采血,检测血清中ALT、AST以及血浆内毒素含量,ELISA法检测血浆及肝组织匀浆中TNF-α、IL-10含量。取部分肝组织及回肠组织作常规病理检查。结果TAA模型组与对照组比较,大鼠血清ALT、AST、血浆内毒素、血浆与肝组织TNF-α、IL-10水平均显着上升（P<0.05）, TNF-α/IL-10的比值明显升高。TAA+BMSC治疗组与TAA模型组相比大鼠血清ALT、AST以及血浆内毒素水平均显着降低,血浆与肝组织IL-10水平明显升高,TNF-α/IL-10的比值明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。TAA+BMSC治疗组与对照组相比,血浆与肝组织TNF-α/IL-10的比值无明显差异（P>0.05）。病理切片显示BMSC能够明显减轻TAA对肝组织的损害,TAA模型组及TAA+BMSC治疗组回肠组织病理显示均有不同程度损害。结论TAA造模形成的ALF大鼠伴有IETM, BMSC尾静脉移植对ALF大鼠IETM有一定的保护作用,可以调节促炎与抗炎因子达到新的平衡,这可能是BMSC移植治疗ALF的作用机制之一。第三部分骨髓间充质干细胞移植对急性肝衰竭大鼠肠源性内毒素血症治疗作用机制的研究实验一骨髓间充质干细胞对脂多糖刺激枯否细胞分泌细胞因子的影响目的探讨在体外条件下BMSC对脂多糖（LPS）刺激后大鼠肝脏枯否细胞（KC）分泌TNF-α的影响。方法采用全骨髓贴壁培养法分离、纯化大鼠BMSC,原位灌流、Percoll密度梯度离心法原代分离培养肝KC,取体外培养48h后的KC用于实验,用LPS（终浓度1μg/ml）刺激KC,BMSC加入KC中建立BMSC共培养体系,实验分为四组：①KC组；②KC+LPS组；③KC+LPS+BMSC组；④KC+LPS+BMSC培养上清组。LPS作用24h、48h、72h后收集培养上清检测培养体系中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的水平。结果无LPS刺激时,正常肝脏KC培养上清中可检测到少量TNF-α,经LPS刺激后KC培养上清中TNF-α含量明显上升；而与BMSC共培养时,TNF-α含量显着减少（P<0.05）；KC与BMSC培养上清共培养时,TNF-α含量与②组相比明显减少,与③组相比TNF-α含量较高,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论BMSC可以抑制LPS刺激后大鼠肝脏KC的活化,减少TNF-α的分泌,BMSC培养上清同样可以抑制KC的活化,但作用比BMSC弱。实验二骨髓间充质干细胞移植对急性肝衰竭大鼠CD14、NF-κB的影响目的观察BMSC移植对ALF大鼠肝组织中内毒素受体CD14及核因子NF-κB表达的影响。方法30只雌性Wistar大鼠,体重250±10g,随机分为对照组、TAA模型组和TAA+BMSC治疗组,每组10只,BMSC移植治疗72h后将各组存活大鼠麻醉,腹主动脉采血后取部分肝组织备检。SABC免疫组化法检测肝组织中内毒素受体CD14及核因子NF-κB的表达。结果对照组肝组织可见少量CD14、NF-κB表达阳性的细胞。TAA模型组与对照组相比,CD14、NF-κB表达明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）。经BMSC治疗后,CD14、NF-κB表达比TAA模型组明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）,与对照组相比,BMSC治疗组CD14、NF-κB仍然很高,差异也有统计学意义（P<0.05）。结论BMSC移植可以抑制肝组织CD14及NF-κB的表达。BMSC移植可能通过抑制内毒素受体CD14及核因子NF-κB的表达来阻断内毒素在体内发挥效应。
段钟平,陈煜[10]（2006）在《人工肝技术及其发展概况》文中指出
二、由生物肝细胞构成的人工肝临床应用的伦理学体会（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、由生物肝细胞构成的人工肝临床应用的伦理学体会（论文提纲范文）
（1）肝衰竭修复替代治疗的现状与发展对策（论文提纲范文）
| 文章快速阅读： |
| 文题释义： |
| 0引言Introduction |
| 1 资料和方法Data and methods |
| 1.1 资料来源 |
| 1.3 数据提取 |
| 1.4 质量评价 |
| 2 结果Results |
| 2.1 人工肝 |
| 2.1.1 非生物型人工肝 |
| 2.1.2生物型人工肝 |
| 2.1.3 混合型人工肝 |
| 2.2 组织工程肝脏 |
| 2.2.1 生物材料的优化 |
| 2.2.2生物支架的抗凝 |
| 2.2.3 组织工程肝脏构建的关键技术 |
| 2.3 异种器官移植 |
| 3 展望Prospects |
（2）海藻酸钙微纤维中包封的骨髓间充质干细胞被诱导向血管内皮分化的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 主要缩略词 |
| 1 绪论 |
| 1.1 问题的提出及研究意义 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.2.1 细胞凝胶复合物的主要形态 |
| 1.2.2 凝胶包封的细胞种类 |
| 1.2.3 细胞凝胶复合体在组织工程中的应用 |
| 1.3 本文研究目的和内容 |
| 1.3.1 研究目的 |
| 1.3.2 研究内容 |
| 1.3.3 本文创新点 |
| 2 海藻酸盐微纤维的微流控制备与表征 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料及方法 |
| 2.2.1 实验材料与仪器设备 |
| 2.2.2 微流控聚焦流装置的加工 |
| 2.2.3 有机玻璃流控支撑件的加工 |
| 2.2.4 组装微流控元件 |
| 2.2.5 构建微纤维生成实验平台 |
| 2.2.6 生成海藻酸钙微纤维 |
| 2.2.7 扫描电镜观察微纤维 |
| 2.2.8 测定缝合强度 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 拉锥毛细管的制取 |
| 2.3.2 有机玻璃流控支撑件的加工 |
| 2.3.3 微流控聚焦流装置的构建 |
| 2.3.4 微纤维生成实验平台的构建 |
| 2.3.5 微纤维外貌形态 |
| 2.3.6 微纤维生成所需的样本流量及其与微纤维直径的关系 |
| 2.3.7 扫描电镜观察微纤维形态 |
| 2.3.8 微纤维的缝合强度 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 骨髓间充质干细胞在微纤维中的生长、增殖及活力的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料及方法 |
| 3.2.1 实验材料与仪器设备 |
| 3.2.2 骨髓间充质干细胞(MSCs)的培养 |
| 3.2.3 微纤维包封骨髓间充质干细胞(MSCs) |
| 3.2.4 细胞-微纤维绿色荧光探针(DiO)染色 |
| 3.2.5 细胞-微纤维Live/Dead染色检测细胞活性 |
| 3.2.6 CCK-8法检测MSCs在微纤维中的增殖能力 |
| 3.2.7 酶联免疫吸附测定(Elisa)测定微纤维中MSCs释放VEGF的浓度 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 MSCs在微纤维中的生长情况 |
| 3.3.2 MSCs在微纤维中的活性检测 |
| 3.3.3 MSCs在微纤维中的增殖的能力 |
| 3.3.4 微纤维中MSCs分泌释放VEGF的浓度含量变化 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 骨髓间充质干细胞在微纤维中的内皮分化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验材料与仪器设备 |
| 4.2.2 骨髓间充质干细胞(MSCs)的培养 |
| 4.2.3 微纤维包封骨髓间充质干细胞(MSCs) |
| 4.2.4 微纤维中血管内皮细胞(VEC)免疫荧光染色 |
| 4.2.5 RT-PCR检测微纤维中血管内皮细胞(VEC)相关基因标志物的表达 |
| 4.2.6 WesternBlot检测微纤维中血管内皮细胞(VEC)相关蛋白标志物的表达 |
| 4.2.7 荧光染色与流式细胞仪分析： |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 微纤维中的MSCs分化成血管内皮细胞(VEC) |
| 4.3.2 微纤维中VEC特异性标志CD31、vWF以及VE-cadherin基因和蛋白的表达 |
| 4.3.3 流式细胞术定量检测微纤维中血管内皮细胞的比例 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 细胞微纤维复合物体内移植安全性的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 实验材料与仪器设备 |
| 5.2.2 骨髓间充质干细胞(MSCs)的培养 |
| 5.2.3 微纤维包封骨髓间充质干细胞(MSCs) |
| 5.2.4 小鼠细胞微纤维移植急性毒性模型的建立 |
| 5.2.5 HE染色法表征器官组织学形态 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 中空管状微纤维合成初探 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料和方法 |
| 6.2.1 实验材料与仪器设备 |
| 6.2.2 十字交叉微流控装置的加工 |
| 6.2.3 构建微纤维生成实验平台 |
| 6.2.4 生成中空状海藻酸钙微纤维 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 基于微丝模塑的十字交叉PDMS微流控芯片构建 |
| 6.3.2 中空微纤维外貌形态 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 本章小结 |
| 7 结论与展望 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| A.作者在攻读博士学位期间科研及发表的论文情况 |
| B.参加的科研项目情况 |
（3）HBV相关慢加急性肝衰竭中医证型分布规律及影响因素（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章 临床资料 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 诊断及分期标准 |
| 1.2.1 诊断标准 |
| 1.2.2 分期标准 |
| 1.2.3 中医诊断标准 |
| 1.3 纳入标准和排除标准 |
| 1.3.1 纳入标准 |
| 1.3.2 排除标准 |
| 1.4 疗效判定标准 |
| 1.5 研究方法 |
| 1.5.1 临床资料的收集 |
| 1.5.2 统计方法 |
| 第二章 结果 |
| 2.1 一般资料 |
| 2.1.1 性别 |
| 2.1.2 年龄 |
| 2.1.3 病程 |
| 2.1.4 职业 |
| 2.1.5 发病诱因 |
| 2.1.6 疾病分期 |
| 2.1.7 HBeAg |
| 2.1.8 HBV-DNA |
| 2.1.9 并发症及合并症 |
| 2.2 中医证型 |
| 2.3 各影响因素与中医证型的关系 |
| 2.3.1 性别与中医证型 |
| 2.3.2 年龄与中医证型 |
| 2.3.3 病程与中医证型 |
| 2.3.4 疾病分期与中医证型 |
| 2.3.5 并发症合并症与中医证型 |
| 2.4 实验指标与中医证型 |
| 2.4.1 HBeAg与中医证型 |
| 2.4.2 HBV-DNA与中医证型 |
| 2.4.3 凝血功能中PTA与中医证型 |
| 2.4.4 TBIL、DBIL与中医证型 |
| 2.4.5 ALT、AST与中医证型 |
| 2.5 中医证型与预后的关系 |
| 第三章 讨论 |
| 3.1 中医对慢加急性肝衰竭的认识 |
| 3.1.1 慢加急性肝衰竭的病名 |
| 3.1.2 病因病机的探讨 |
| 3.1.3 证型与辨证论治探讨 |
| 3.1.4 慢加急性肝衰竭的中医治法 |
| 3.2 .现代医学对慢加急性肝衰竭的认识 |
| 3.2.1 慢加急性肝衰竭的定义 |
| 3.2.2 HBV相关慢加急性肝衰竭发病的诱因 |
| 3.2.3 HBV相关慢加急性肝衰竭发病机制 |
| 3.2.4 慢加急性肝衰竭对机体的影响 |
| 3.2.5 HBV相关慢加急性肝衰竭预后影响因素 |
| 3.3 .中医证型分布规律分析 |
| 3.3.1 一般资料分析 |
| 3.3.2 HBV相关慢加急性肝衰竭的证型分析 |
| 3.4 中医证型分布与实验检查指标 |
| 3.4.1 观察指标的选取 |
| 3.4.2 中医证型与实验指标的关系 |
| 3.5 中医证型与预后分析 |
| 结论 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（4）基于微囊化猪肝细胞的生物人工肝治疗食蟹猴急性肝衰竭的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 食蟹猴急性肝功能衰竭模型的建立及评价 |
| 第一节 食蟹猴药物性急性肝功能衰竭模型的建立及评价 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 3 方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 第二节 食蟹猴外科急性肝功能衰竭模型的建立及评价 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 3 方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 基于微囊化猪肝细胞的生物人工肝系统安全性及有效性的评估 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 3 方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| References |
| 中英文缩略词简表 |
| 攻读博士期间的成果 |
| 致谢 |
（5）肝脏脱细胞生物支架的制备及诱导骨髓间充质干细胞肝向分化的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 一、肝脏组织工程与再生医学研究 |
| 1. 组织工程与再生医学的发展 |
| 2. 肝脏胚胎发育和调控机制 |
| 3. 种子细胞类型和来源 |
| 4. 生物人工肝 |
| 5. 细胞移植治疗 |
| 6. 肝脏组织工程 |
| 二、全器官脱细胞生物支架 |
| 1. 脱细胞支架的制备 |
| 2. 脱细胞支架的灭菌 |
| 3. 脱细胞支架的鉴定 |
| 4. 脱细胞支架的结构和功能 |
| 5. 全器官组织工程的研究进展 |
| 6. 脱细胞支架的研究前景 |
| 三、干/祖细胞肝向分化的体外诱导和鉴定 |
| 1. 体外诱导分化的常见方案 |
| 2. 肝向分化程度的检测手段 |
| 3. 干/祖细胞肝向分化的调控机制 |
| 实验一 DLB 制备及其细胞相容性和免疫原性的研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验二 DLB 体外诱导 MSCS 向肝系细胞分化的研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验三 DLB 预处理 MSCS 对慢性肝纤维化的治疗作用 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（6）人端粒酶逆转录酶与Caspase-3 si-RNA构建永生化人肝细胞株（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 慢病毒载体PLENT6.3/V5-HTERT-IRES-RFP的构建 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 CASPASE-3 SIRNA慢病毒载体的构建 |
| 材料 |
| 方法 |
| 统计分析 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 人原代肝细胞的分离培养 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 永生化人肝细胞株的建立及鉴定 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 永生化人肝细胞株的安全性研究 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 缩写词简表 |
| 致谢 |
| 博士研究生期间发表论文情况 |
| 附件 |
（7）生态饭店的理论构想及实现途径研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 引言 |
| 1.1 选题背景和研究意义 |
| 1.1.1 选题背景 |
| 1.1.2 研究意义 |
| 1.2 国内外相关研究进展 |
| 1.2.1 生态饭店的研究进展 |
| 1.2.2 饭店生态系统及管理研究 |
| 1.2.3 饭店环境管理研究进展 |
| 1.2.4 生态建筑研究进展 |
| 1.2.5 研究不足与展望 |
| 1.3 生态饭店的理论支撑 |
| 1.3.1 基础生态学理论 |
| 1.3.2 应用生态学理论 |
| 1.3.3 现代饭店管理理论 |
| 1.4 研究内容、方法与技术路线 |
| 1.4.1 研究内容 |
| 1.4.2 研究方法 |
| 1.4.3 技术路线 |
| 2 饭店与饭店生态系统 |
| 2.1 饭店的属性变化与再定义 |
| 2.1.1 饭店的属性变化 |
| 2.1.2 饭店定义的再研究 |
| 2.2 饭店生态系统分析 |
| 2.2.1 饭店人工复合生态系统 |
| 2.2.2 饭店生态系统的组成 |
| 2.2.3 饭店生态系统的结构 |
| 2.2.4 饭店生态系统的功能 |
| 2.2.5 饭店生态系统的特征 |
| 2.3 本章小结 |
| 3 饭店系统的生态问题 |
| 3.1 关于饭店自然、环境与生态问题的辨析 |
| 3.1.1 饭店生态系统中的自然、环境、生态之间的联系和区别 |
| 3.1.2 饭店环境管理理论将被饭店生态思想所取代 |
| 3.2 饭店生态问题的系统分析 |
| 3.2.1 饭店自身的生态问题 |
| 3.2.2 饭店对人的生态问题 |
| 3.2.3 人对饭店的生态问题 |
| 3.2.4 饭店对环境的生态问题 |
| 3.2.5 环境对饭店的生态问题 |
| 3.3 本章小结 |
| 4 生态饭店的理论构架 |
| 4.1 生态饭店的定义与内涵 |
| 4.1.1 绿色与生态的辨析 |
| 4.1.2 生态饭店的内涵理解 |
| 4.2 生态饭店的组成 |
| 4.2.1 生态饭店中人的因子 |
| 4.2.2 生态饭店中的环境因子 |
| 4.3 生态饭店的结构 |
| 4.3.1 生态饭店的三元结构 |
| 4.3.2 生态饭店的金字塔结构 |
| 4.4 生态饭店的功能 |
| 4.4.1 功能一:经济高效运行 |
| 4.4.2 功能二:安全健康舒适 |
| 4.4.3 功能三:环境友好持续 |
| 4.4.4 功能四:社会和谐稳定 |
| 4.5 生态饭店的特征 |
| 4.5.1 生态饭店的自然特征 |
| 4.5.2 生态饭店的经济特征 |
| 4.5.3 生态饭店的文化特征 |
| 4.6 生态饭店的生态伦理 |
| 4.6.1 人和饭店在系统中的道德规范 |
| 4.6.2 饭店"以人为本"的生态准则 |
| 4.6.3 鉴别饭店生态行为的基本原则 |
| 4.6.4 生态饭店产品的道德伦理尺度 |
| 4.6.5 环境责任与市场结合的饭店伦理 |
| 4.6.6 生态饭店的社会责任和环境责任 |
| 4.7 生态饭店的分类 |
| 4.8 本章小结 |
| 5 生态饭店的实现途径 |
| 5.1 生态饭店实现途径的关键 |
| 5.1.1 传统环境措施的局限性 |
| 5.1.2 构建生态饭店的三要素 |
| 5.2 生态饭店的设计建设 |
| 5.2.1 饭店设计的生态化 |
| 5.2.2 饭店建设的生态化 |
| 5.2.3 饭店改扩建的生态化 |
| 5.3 生态饭店的系统管理 |
| 5.3.1 饭店系统管理理论的创新 |
| 5.3.2 生态饭店系统管理的优势 |
| 5.3.3 生态饭店系统管理的原则 |
| 5.3.4 生态饭店系统管理的内容 |
| 5.4 生态饭店的社会支撑 |
| 5.4.1 政策体制的支撑 |
| 5.4.2 生态技术的支撑 |
| 5.4.3 生态人才的支撑 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 生态饭店的案例研究——江西景德镇市紫晶宾馆 |
| 6.1 景德镇与紫晶宾馆概况 |
| 6.1.1 作为案例研究的理由 |
| 6.1.2 景德镇市概况 |
| 6.1.3 紫晶宾馆简介 |
| 6.2 紫晶宾馆的生态现状分析 |
| 6.2.1 重要生态指标检测分析 |
| 6.2.2 紫晶宾馆的生态优势 |
| 6.2.3 紫晶宾馆的生态问题 |
| 6.3 紫晶宾馆的生态评价 |
| 6.3.1 评价原则与评价方法 |
| 6.3.2 指标筛选与权重确定 |
| 6.3.3 紫晶宾馆的生态评价 |
| 6.4 紫晶宾馆生态化的实现途径 |
| 6.4.1 硬件途径 |
| 6.4.2 软件途径 |
| 6.5 本章小结 |
| 7 结论 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 主要创新点 |
| 7.3 几点建议 |
| 7.4 尚待解决的问题 |
| 参考文献 |
| 附录:攻读学位期间的主要学术成果 |
| 致谢 |
（8）酵母双杂交筛选与TCTP相互作用的蛋白及其功能的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 酵母双杂交TCTP诱饵和猎物载体构建及自激活检测 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 TCTP酵母双杂交文库筛选及阳性克隆生物学分析 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 免疫共沉淀和GST pull-down验证TCPT1与Skp2和FS相互作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第四部分 TCTP蛋白对Skp2蛋白功能的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 配方 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）骨髓间充质干细胞移植对急性肝衰竭大鼠肠源性内毒素血症的治疗作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 正文 |
| 前言 |
| 第一部分 骨髓间充质干细胞的分离培养及其生物学特性的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 骨髓间充质干细胞移植对急性肝衰竭大鼠肠源性内毒素血症的影响 |
| 实验一 急性肝衰竭大鼠伴肠源性内毒素血症模型的建立 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 骨髓间充质干细胞移植对急性肝衰竭大鼠内毒素及细胞因子的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 骨髓间充质干细胞移植对急性肝衰竭大鼠肠源性内毒素血症治疗作用机制的研究 |
| 实验一 骨髓间充质干细胞对脂多糖刺激枯否细胞分泌细胞因子的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 骨髓间充质干细胞对肝衰竭大鼠CD14、NF-K B表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 综述 |
| 综述一 急性肝衰竭的研究现状及治疗进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 骨髓间充质干细胞移植在肝衰竭治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩写 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（10）人工肝技术及其发展概况（论文提纲范文）
| 1 传统血液净化和人工肝支持技术的发展 |
| 2 现代主要人工肝支持技术的发展 |
| 2.1 连续性血液净化技术: |
| 2.2 组合型非生物型人工肝: |
| 2.3 生物型或组合生物型人工肝: |
四、由生物肝细胞构成的人工肝临床应用的伦理学体会（论文参考文献）
- [1]肝衰竭修复替代治疗的现状与发展对策[J]. 郭伟,卢姗,范红,李君. 中国组织工程研究, 2020(20)
- [2]海藻酸钙微纤维中包封的骨髓间充质干细胞被诱导向血管内皮分化的研究[D]. 刘明颖. 重庆大学, 2018(05)
- [3]HBV相关慢加急性肝衰竭中医证型分布规律及影响因素[D]. 高崇勇. 成都中医药大学, 2017(01)
- [4]基于微囊化猪肝细胞的生物人工肝治疗食蟹猴急性肝衰竭的实验研究[D]. 蔡磊. 南方医科大学, 2017(11)
- [5]肝脏脱细胞生物支架的制备及诱导骨髓间充质干细胞肝向分化的研究[D]. 季茹. 第四军医大学, 2013(02)
- [6]人端粒酶逆转录酶与Caspase-3 si-RNA构建永生化人肝细胞株[D]. 吴青松. 南方医科大学, 2012(04)
- [7]生态饭店的理论构想及实现途径研究[D]. 洪文艺. 中南林业科技大学, 2011(05)
- [8]酵母双杂交筛选与TCTP相互作用的蛋白及其功能的研究[D]. 张国寿. 福建医科大学, 2011(09)
- [9]骨髓间充质干细胞移植对急性肝衰竭大鼠肠源性内毒素血症的治疗作用及机制研究[D]. 郝彦琴. 山西医科大学, 2010(10)
- [10]人工肝技术及其发展概况[J]. 段钟平,陈煜. 现代医药卫生, 2006(21)