一、恶性肿瘤端粒酶逆转录酶基因的表达及调控研究进展（论文文献综述）
唐铃丰[1]（2021）在《人端粒酶逆转录酶hTERT鉴别乳腺良恶性肿瘤的Meta分析》文中指出目的系统评估人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）基因检测鉴别诊断乳腺良恶性肿瘤的临床价值。方法检索CNKI、CBM、维普、Wan Fang Data、Pub Med、The Cochrane Library（2020年10期）、Web of Science、EMbase数据库中与hTERT基因检测鉴别乳腺良恶性肿瘤相关的文章,检索时间均由建库时间至2020年10月9日。提取纳入文献基本资料并通过QUADAS标准评价研究质量。使用Stata 15.0和Meta-Disc 1.4软件对数据进行统计分析。首先通过ROC曲线和Spearman相关系数来检验有无阈值效应,若有阈值效应,则拟合ROC曲线并计算AUC及Q*指数;若无阈值效应,则采用卡方检验分析异质性,并结合I2定量判断异质性的大小。然后使用meta回归分析探寻异质性来源,进行亚组分析。最后通过漏斗图分析发表偏倚。结果本研究一共纳入了17篇文献,共1436例患者（乳腺恶性肿瘤852例,乳腺良性肿瘤584例）。结果显示,hTERT诊断乳腺恶性肿瘤的合并敏感度(Sen合并)为0.81[95%CI（0.79,0.84）],合并特异度(Spe合并)为0.83[95%CI（0.79,0.86）],合并阳性似然比(+LR合并)为4.75[95%CI（3.35,6.74）],合并阴性似然比(-LR合并)为0.21[95%CI（0.15,0.30）]以及合并诊断优势比(DOR合并)为26.93[95%CI（15.02,48.28）]。所有结局指标I2均大于50%,因此采用随机效应模型进行Meta分析。对全部因素进行meta回归分析,结果显示异质性主要来源为作者国家,剔除两篇国外文献后行亚组分析,采用固定效应模型计算合并DOR为35.89,AUC=0.9242,Q*=0.8582。结论hTERT基因检测鉴别诊断乳腺良恶性肿瘤有较好的灵敏度及特异度,诊断试验的判别效果较好,其有助于临床上乳腺良恶性肿瘤的鉴别。
刘德豪[2]（2021）在《外周血白细胞端粒长度与端粒酶活性对非小细胞肺癌患者预后的影响》文中进行了进一步梳理目的:探讨非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）患者外周血白细胞端粒长度以及端粒酶活性对患者预后的影响。方法:本研究病例选取2016年4月至2017年6月期间在保定市第一中心医院心胸外科确诊为NSCLC患者,经纳入标准及排除标准筛选后,选取符合入组标准的患者55例。依据端粒酶活性和端粒DNA长度的特定值进行分组:长链高活性组7例、长链低活性组14例、短链低活性组14例、短链高活性组20例。全部患者均进行一般资料收集、外周血采集以便检测NSCLC患者白细胞端粒长度和端粒酶活性代表物。在患者入院期间以及出院后均对患者生存时间及预后效果进行随访,以明确患者外周血白细胞端粒长度、端粒酶活性与患者治疗后生存时间的相关性。结果:经研究,各组患者之间年龄、性别、肿瘤病理分型、是否吸烟未见明显相关性（P>0.05）,总体对比患者临床TNM分期有统计学意义（P=0.025）。各组患者自身端粒酶活性与端粒长度无相关性（r=-0.112,P=0.228）。不同分组NSCLC患者生存时间:端粒DNA长链端粒酶低活性组患者生存时间为（30.93±1.06）月;端粒DNA长链端粒酶高活性组患者生存时间为（29.48±2.64）月;端粒DNA短链端粒酶高活性组患者生存时间为（14.70±1.65）月;端粒DNA短链端粒酶低活性组患者生存时间为（19.98±1.68）月。整体对比不同组别患者预后生存时间（OS）具有统计学意义（P<0.001）。通过Kaplan-Meier曲线组间两两对比患者预后生存时间发现:整体对比有统计学意义,不同组别之间两两对比:端粒DNA长链高活性组与端粒DNA长链低活性组对比、端粒DNA短链高活性组与短链低活性组对比、端粒DNA长链低活性组与端粒DNA短链低活性组对比均无统计学意义（P>0.05）,端粒DNA长链高活性组与端粒DNA短链高活性组对比、端粒DNA长链低活性组与端粒DNA短链高活性组对比,结果具有统计学意义（P<0.05）。经Cox风险比例回归分析得出:患者年龄、临床TNM分期、端粒长度以及端粒酶活性是影响NSCLC患者预后生存的独立风险因素。结论:评价非小细胞癌患者预后生存的独立风险因子包括患者年龄、肿瘤TNM分期、外周血白细胞端粒长度以及端粒酶活性。其中外周血白细胞端粒长度对于患者治疗效果以及生存时间的影响较其他因素更为明显。
沈晓宝[3]（2021）在《基于PI3K/AKT/mTOR信号通路和端粒酶逆转录酶靶标的小分子药物的设计、合成及构效研究》文中研究说明调节端粒酶活性和PI3K/AKT/mTOR信号通路,可以调控细胞系的生长,诱导肿瘤细胞凋亡,端粒酶活性调控是肿瘤治疗研究的热点。第一章在紫草素骨架基础上进行了衍生化,此类衍生物通过自噬调节PI3K/AKT/mTOR信号通路;第二章发展了系列二氢吡唑-嘧啶骨架化合物,并研究了其对端粒酶抑制性能,抑制端粒酶活力可以调控异常细胞的繁殖周期,促进癌细胞的凋亡。利用计算机药物设计软件（Discovery Studio）,对已有的活性化合物化学结构进行分析,分别以PI3K/AKT/mTOR信号通路和端粒酶逆转录酶为靶标,同时结合拼合原理和生物电子等排原理,设计合成了多个相关化合物并进行相关的生物活性测试。紫草素是中药紫草的主要成分,有着很好的抗肿瘤作用,但因为其较差的选择性和较高的细胞毒性,在抑制癌细胞的同时,其毒性同样能够破坏有序生长的细胞,因此在保持其较高的抗癌细胞活性同时降低其对正常细胞的毒性是紫草素类化合物需要解决的主要问题。通过紫草素衍生物的构效关系分析,以期筛选到对癌细胞具有较好抑制活性同时对正常肝细胞的毒性较低的化合物。经对紫草素构效分析,发现侧链羟基不是活性所必需的,可以作为是主要的修饰位点。酰化和醚化均能在低浓度下保持较强的抗肿瘤活性,而双键的引入会明显提高活性。为了合成更高效、毒性更小的衍生物,根据紫草素的分子对接（其中一种化合物的最低对接能为15.7597 k Cal/M,紫草素的最低对接能为6.13917 k Cal/M）和药效团分析,设计合成了23个紫草素衍生物。此外,对其抗癌活性进行了初步探讨,大部分衍生物对肿瘤细胞有一定的抑制作用,特别是化合物12对SGC-7901细胞的IC50为4.1±2.6μM,并通过Annexin V/PI染色、免疫荧光、westernblot等方法探讨了化合物12对SGC-7901细胞的抗癌机制分子对接。这些结果表明,化合物12通过调节PI3K信号通路诱导细胞凋亡和自噬,对肿瘤细胞系的凋亡起到积极作用。端粒酶在肿瘤细胞中起着至关重要的作用,抑制端粒酶活性可以抑制癌细胞的增殖,促进癌细胞的凋亡。端粒酶具有有效性和特异性,已成为抗癌药物的新靶点之一。由于生殖细胞和肿瘤细胞的端粒在端粒酶作用下不断修复,在体外长期治疗后,无法达到预期的与功能性复制衰老相关的临界端粒长度。因此,在小分子端粒酶抑制方面仍存在一些问题,如端粒酶的激活和抑制机制尚不清楚,端粒酶抑制对生殖细胞、干细胞、胚胎干细胞的毒副作用仍存在。很多吡唑衍生物具有重要的药理活性,是药物研究的核心骨架。传统的药物设计方法在药物合成史上起着重要的作用,另一方面计算机辅助药物设计等新技术是新药开发不可忽略的。随着大量靶标蛋白等复合物共晶结构的解析,为基于靶标设计的药物分子提供了基础。本章在骨架跃迁,拼合原理等传统药物的基础上,结合新技术,以端粒酶逆转录酶为靶标,根据其结构特性,首先确定了二氢吡唑和嘧啶的核心骨架,同时依据分子对接结果,对其左右侧疏水区域进行了多官能团修饰,设计合成了67个新型二氢吡唑嘧啶类化合物,以期解决现有端粒酶抑制剂毒性较大的问题,从而开发新型生物活性高,毒性低的端粒酶逆转录酶抑制剂先导化合物。本章采用CCDK-8法对合成化合物进行细胞增殖测试,同时针对端粒酶进行酶活测试,通过细胞周期和凋亡检测了目标化合物91的作用机制。首先结合文献和本课题组前期工作结果,设计了4甲基吡唑和嘧啶结构分子,体外细胞测试和酶活力检测,这些结构都具有较好的端粒酶抑制和肿瘤细胞增殖活性。5-（1-苄基-4-甲基-4,5-二氢-1H-代-吡唑-3-基）-N-（3-甲氧基苄基）嘧啶-2-胺化合物29对端粒酶抑制活性达到7.58±0.69μM,对人乳腺癌细胞MCF7,人卵巢癌细胞SKOV3,人恶性黑色素瘤细胞A-375的IC50分别为6.91±0.43、16.37±0.83和10.06±0.34μM,且细胞毒性很小。同时对比化合物29与已有药物的分子对接结果,也说明该骨架对端粒酶具有较好的相互作用。在化合物29的基础上,探讨了二氢吡唑上甲基对该类化合物活性的影响。发现吡唑甲基在生物活性中不是必须基团。而当嘧啶取代基为不同取代的苄胺时能进一步增加相关的生物活性,但细胞毒性也随之增加如化合物61端粒酶抑制活性(IC50=0.28±0.04μM)优于阳性对照组BIBR1532的水平(IC50=0.39±0.05μM),对三种肿瘤细胞的抗增殖能力也能达到微摩尔水平,但细胞毒性较大。顺着抗增殖和端粒酶抑制活性指导的方向,不断的对各基团进行修饰和改造,得到化合物91（2-（4-乙基哌嗪-1-基）-5-（1-苯基-4,5-二氢-1H-吡唑-3-基）嘧啶）,其端粒酶抑制活性为IC50=0.57±0.13μM细胞增殖活性IC50（MCF-7、A375和SKOV-3细胞系）分别为:2.06±0.88、3.26±0.43和0.97±0.29μM,达到阳性对照组阿霉素的水平,通过细胞周期和凋亡实验进一步验证。酶活测试结果表明该化合物可以抑制端粒酶活性,细胞实验证实了该化合物可以诱导细胞凋亡达到抑制肿瘤细胞的目标。化合物91与端粒酶蛋白分子对接能最高值为22.852 k J/M,最低值为15.7847k J/M,平均值19.06663 k J/M,分子对接计算结果数据表明无论是对接能,还是对接相互作用能的值都与实验结果相吻合。总体结论为:二氢吡唑环上的甲基不是必须基团,而具有Π相互作用的芳香基团有利于与蛋白质分子相互作用。嘧啶环上取代基为不同取代的苄基时,虽然具有较好的生物活性,但其细胞毒性也较大。而当嘧啶环上的取代为哌嗪时,不仅有助于此类结构分子活性的提升还大大降低了细胞毒性,可能是因为哌嗪环能够增加此类分子与DNA的相互作用。最终目标化合物91具有良好生物活性和低毒性,是潜在的端粒酶逆转录酶抑制剂,对新型端粒酶抑制的开发具有重要的意义。
郑建波[4]（2020）在《肾细胞癌组织中hTERT启动子甲基化水平与其临床病理意义》文中认为研究背景:肾癌是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,全世界每年诊断出超过40万名新患者,其中约17万名患者死于肾癌。近些年来肾癌的发病率呈上升趋势,其发病机制仍未被明确。近来发现端粒及端粒酶的活性在肿瘤包括肾癌等疾病的发生发展中可能起到了重要作用。端粒是位于真核细胞染色体末端的DNA-蛋白质复合体,由重复排列的富含鸟嘌呤的六聚体DNA及特定的端粒结合蛋白组成。对维持基因组和染色体稳定起重要作用。端粒酶是一种核糖核蛋白聚合酶,是一种能够延长端粒重复序列的酶,通过在人类染色体末端添加5’-TTAGGG-3’重复序列来维持端粒末端的T-Loop结构。在出生后的体细胞中端粒酶的表达通常受到抑制,如果其失调可能与致癌性有关。虽然它在大多数正常人类细胞中被抑制,但在高达90%的人类恶性肿瘤中可检测到端粒酶活性。端粒酶主要有人端粒酶逆转录酶（hTERT）、人端粒酶RNA组分（hTR）及相关蛋白3个不同的亚基组成,hTERT是端粒酶全酶的催化亚基,是端粒酶活性的限速因子。已知人hTERT基因的表达和功能通过多种途径调节,包括转录因子,启动子甲基化/突变,染色质重塑,交替剪接,蛋白质修饰导等。在这些调节手段中,转录调节是最重要的。自从发现正常细胞上大多数癌基因启动子存在高甲基化后,甲基化的遗传修饰被引起广泛的兴趣。DNA甲基化,一般发生在CpG位点。hTERT启动子区域没有TATA和CAAT盒,但含有一个致密的富含CG的CpG岛,这表明DNA甲基化在hTERT表达调控中可能起潜在的作用。对重亚硫酸氢盐处理后的基因组组测序,Theodora等人研究了 37种细胞系中hTERT的启动子甲基化状态,包括正常细胞,干细胞和癌细胞。虽然他们研究没有发现特异性甲基化位点或区域与hTERT表达相关,却证实了在端粒酶阴性的SUSM-1细胞系中通过去甲基化处理诱导了 hTERT表达。目前一些研究表明hTERT启动子的CpG岛甲基化与体内较低的端粒酶活性有关,然而更多研究表明hTERT启动子区域的超甲基化与hTERT mRNA表达正相关,这与我们通常认为的基因上某个区域的甲基化升高导致该基因的表达降低相反,因此DNA甲基化在hTERT表达和端粒酶活性调节中的潜在作用仍然有待阐明。肾细胞癌（RCC）是肾脏恶性肿瘤中最常见的癌症病理类型,诊断时转移率为25-30%。据报道,hTERT基因表达可以通过各种反式作用元件和顺式作用元件调节,包括 c-Myc,Sp1,WT1,HIF-1α,P53,TGF-β,SMYD3,染色质重塑和启动子突变。然而很少有研究涉及RCC中hTERT启动子的DNA甲基化状态。为此,我们使用焦磷酸测序定量评估了 hTERT启动子区域中转录上游的筛选出的5个CpG位点的甲基化水平,进一步探讨hTERT启动子甲基化百分比和hTERT表达,端粒酶活性,临床分期和患者预后之间的相关性,并对hTERT启动子甲基化水平与其表达和端粒酶活性之间的关系进行了探讨,探索hTERT启动子甲基化在肾肿瘤发生发展中的潜在作用,筛选预测肾肿瘤预后的生物标志物。研究目的:通过收集103例肾细胞癌患者的年龄、性别、肿瘤类型、TNM分期、Fuhrman分级等临床病理特征并随访手术后预后情况,检测肾细胞癌及配对癌旁正常组织的hTERT启动子甲基化水平、hTERT mRNA相对表达丰度,端粒酶活性。分析hTERT启动子甲基化水平与hTERT mRNA相对表达丰度,端粒酶活性3者之间的相互关系及其与肾细胞癌患者年龄、性别、肿瘤类型、TNM分期、Fuhrman分级等特征之间的关系,对hTERT启动子甲基化水平在肾细胞癌中的潜在作用机制进行初步的研究。研究对象及方法:收集2009年至2014年期间,在山东大学齐鲁医院入院手术的103名患者中,通过根治性肾切除术（n=99）或肾单位保留手术（n=4）获得成对的肾肿瘤组织和与肿瘤相邻的正常组织（NAT）。所有标本均通过组织病理学检查确认诊断。将标本在-80℃冷冻直至随后的实验室分析。对这些患者进行随访研究,随访时间从2009年1月1日起,截止时间2016年11月30日。以手术时间作为观察起点,直至患者出现死亡,记录每个病例的年龄、性别、左右、病理类型、TNM分期、Fuhrman分级、生存时间等资料。按照DNeasy组织试剂盒（Qiagen Ltd,Venlo,Netherlands）说明书从冷冻组织标本中提取DNA。通过分光光度法测量DNA浓度并调节至50ng/ml。采用EpiTect Bisulfite试剂盒（Qiagen）,严格按照产品说明书进行基因组DNA的亚硫酸氢盐修饰。通过采用特异性的引物对亚硫酸氢盐转化的基因组DNA进行PCR,PCR结果确认DNA的亚硫酸氢盐转化成功。使用PyroMark PCR试剂盒（Qiagen）进行 PCR。使用 PyroMark Assay Design Software 2.0 设计引物。对于所有样品,用0.5μl亚硫酸氢盐转化的基因组DNA进行PCR反应。使用生物素标记的引物（反向引物）通过使用链霉抗生物素蛋白包被的Sepharose珠（GE Healthcare,UK）纯化PCR产物。将PCR产物与Sepharose珠结合,纯化,洗涤,用0.2M NaOH溶液变性,并再次洗涤。然后将0.3μM测序引物与纯化的单链PCR产物退火,并根据产品说明在PyroMark Q96（Qiagen）中进行焦磷酸测序。为了总亚硫酸氢盐转化的内部对照,焦磷酸测序的区域中的非CG胞嘧啶也被包括。使用TRizol试剂（Invitrogen）从组织样品中提取总细胞RNA。使用总共1μg的RNA用M-MLV逆转录酶（Thermo,Lithuania）进行逆转录。使用SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems,Foster City,CA）在 7000 实时 PCR系统（Applied Biosystems）中进行QPCR。β2-作为内参照物。根据阈值循环值,使用2-△△Ct方法计算标本中hTERT mRNA的相对水平。使用TeloTAGGG端粒酶PCR ELISA试剂盒（Roche Diagnostics）测定端粒酶活性。提取1.0μg蛋白质进行测定,并且在端粒酶-引物延伸反应后进行30个PCR循环。使用ELISA显色反应检测PCR产物。端粒酶活性水平表示为吸光度[测定在450nm上的OD值（参考波长690nm）]。对正态分布的采用t检验。不符合正态分布的未配对组采用Mann-Whitney U检验,配对组采用Wilcoxon秩和检验,3组样本之间比较采用多样本比较的秩和检验,Kruskal-Wallis法来进行整体分析及两两比较。对于指标与预后之间的关系,采用Kaplan-Meier分析,对Log-rank检验有意义的单因素纳入多因素Cox回归分析,报告的所有P值均为双尾检验,并且采用值小于0.05。SPSS 16.0软件统计结果提示P=0.000,做图时按P<0.001显示处理。研究结果:我们提取12个肾癌组织和相对应癌旁正常组织（NAT）的DNA,采用重亚硫酸盐转化后,设计了 3对PCR引物对hTERT启动子的三个区域的14个CpG位点进行焦磷酸测序。在所有14个检查的CpG位点中发现,与NAT相比,我们发现肾癌组织中的hTERT启动子区CpG甲基化百分比更高,按P小于0.05,2组之间均有显着统计学意义。同时在三个区域PCR过程中,我们发现包含位点1至5区域的PCR扩增信号最稳定。以这个区域为研究对象,我们扩大检测样本,使用焦磷酸测序检测了 103名肾癌患者配对样本中位点1至位点5的甲基化百分比。我们发现与NAT相比,肾癌组织中所有5个CpG位点都显着高甲基化。在所有103个肾肿瘤组织和配对NAT中,患者的年龄与MMP1-5（means of methylation percentage of CpG sitel to site2）之间均不存在线性相关性。肾癌组织中MMP 1-5和hTERT全长mRNA表达（R2=0.450）之间观察到较高的正相关。一致地,在MMP 1-5和端粒酶活性之间也发现了正相关（R2=0.446）。我们的数据表明hTERT启动子在肾癌组织中是高甲基化的,并且甲基化水平与hTERT mRNA表达和端粒酶活性密切相关。我们研究hTERT启动子甲基化水平与临床病理特征之间的关联,发现所有患者的甲基化与年龄和性别无关。同时我们发现较高水平的hTERT启动子甲基化水平与疾病阶段显着相关,但是我们的数据发现Fuhrman等级之间与hTERT甲基化水平没有统计学显着差异。同时,透明细胞RCC（ccRCC）和非ccRCC之间的hTERT启动子甲基化水平没有显着差异。肾肿瘤组织与NAT相比,全长hTERT mRNA表达及端粒酶活性有明显的统计学差异,hTERT表达与端粒酶活性之间存在直线相关性。经单因素的分析,患者的TNM分期,细胞Fuhrman分级,hTERT启动子甲基化水平,hTERT mRNA表达水平,端粒酶活性对肾癌术后生存率有影响,经多因素Cox回归分析发现AJCC分期、hTERT启动子甲基化水平是影响肾癌病人预后的独立因素。研究结论:综上所述,我们通过对人肾癌中hTERT启动子甲基化水平、hTERT表达及端粒酶活性与临床特征和预后之间的相关性研究,我们发现hTERT启动子甲基化与hTERT表达/端粒酶活性之间存在正相关,hTERT表达与端粒酶活性之间存在正相关。hTERT启动子甲基化此外,我们发现了 hTERT启动子甲基化、hTERT mRNA表达及端粒酶活性与临床结果之间的密切关联,是肾癌预后不良的危险因素。hTERT启动子CaAvg（按48.3%分层）,AJCC分层是影响肾癌患者手术之后预后的独立因素,hTERT启动子甲基化水平影响hTERT mRNA表达及端粒酶活性,影响肾癌预后,揭示这种表观遗传改变可以作为RCC诊断和预后的有价值的生物标志物。
刘晓亭[5]（2020）在《新型核酸纳米载体的设计及在肿瘤细胞成像和药物递送中的应用研究》文中研究表明目前医学水平和诊断技术得到了快速的发展,但癌症的发病率和死亡率仍然处在较高水平,是威胁人类健康和生命的重大疾病之一。癌症的早期诊断和精准治疗是决定癌症能否得到成功治愈的关键因素。近年来,肿瘤标志物的不断发现为癌症早期诊断提供了保障,细胞内肿瘤标志物种类较多,表达水平也有所差异,对于一些低表达丰度的肿瘤标志物需要建立更加灵敏的分析方法。另一方面,化学治疗作为癌症治疗的经典方法之一,但化疗通常会受到化疗药物低溶解性、强的毒副作用及耐药性等问题的制约,因此,需要开发具有特定功能的纳米载体进行化疗药物的递送。本论文致力于新型核酸纳米载体的设计及在肿瘤细胞成像和药物递送方面的应用研究。通过对目前已报道的核酸纳米载体进行总结,发现随着核酸纳米载体研究的深入,仍然存在一些不足和挑战:（1）现有的核酸纳米载体多为细胞质递送化疗药物,耐药细胞中细胞膜上过表达的外排转运体会将细胞质中的药物重新泵出细胞,降低细胞内的药物浓度,限制化疗效果,因此,如何构建药物作用位点靶向的核酸纳米载体对于提高药物的作用效果具有重要意义;（2）在应对化疗过程中出现的药物耐受性的问题上,常用的策略是利用纳米载体避开外排转运体介导的药物外排,而直接抑制外排转运体的表达是一种更根本的策略来应对药物耐受性;（3）细胞内许多肿瘤标志物的表达丰度偏低,目前多数具有细胞成像和药物递送双重功能的核酸纳米载体输出方式为1:1式,极大的限制了检测的灵敏度和药物释放,构建具有信号放大特性的核酸纳米载体来实现活细胞内肿瘤标志物的灵敏检测及药物释放是一个关键问题。基于以上问题和挑战,设计了三种新型的核酸纳米载体用于活细胞内肿瘤标志物的成像及药物递送。本文主要分为以下五章内容:第一章为绪论部分,主要分析了癌症诊断和治疗上所面临的严峻挑战,介绍了用于核酸纳米载体设计的经典核酸结构单元、金纳米颗粒,概述了核酸纳米载体在癌症诊断与治疗中的研究进展,并以此为基础总结了目前核酸纳米载体在细胞成像和药物递送上存在的问题。第二章,构建了一种内源性刺激响应核靶向的纳米载体（AuNP-mRS-DSs）用于活细胞内MRP1 mRNA的成像和药物递送。纳米载体由三部分组成:（ⅰ）金纳米颗粒（AuNP）,用于装载DNA和淬灭荧光;（ⅱ）mRNA识别序列（mRS）通过金-硫键连接到AuNP表面,用于MRP1 mRNA的特异性识别;（ⅲ）可拆卸的亚单位（DS）,由Cy5标记的DNA连接链和核仁素识别基序（含AS1411适体）杂交而成,并通过DNA连接链连接到mRS上,用于装载阿霉素（Dox）、结合核仁素及荧光信号的输出。首先,纳米载体的核仁素识别基序靶向肿瘤细胞表面过表达的核仁素,然后整个纳米载体在核仁素介导的内化作用下进入细胞。随后,mRS特异性识别过表达的MRP1 mRNA,从而释放束缚的DS,被AuNP淬灭的Cy5荧光恢复。最后,利用核仁素从细胞质到细胞核穿梭的作用,DS靶向细胞核递送Dox。细胞内荧光成像可以实现耐药细胞和非耐药细胞的区分。此外,通过荧光成像可以观察到耐药细胞中释放的可拆卸亚单位的分布。与游离阿霉素（IC50>8.00 μM）相比,将 Dox 装载到 AuNP-mRS-DSs 后对 MCF-7/ADR细胞的IC50更低为2.20 μM,这表明利用核酸纳米载体载药对耐药的乳腺癌细胞具有极好的抑制效果。该纳米载体在癌症化疗敏感性预测和耐药性的规避上具有重要意义。第三章,构建了多功能分子信标（MBs）修饰的金纳米颗粒作为纳米载体（MBs-AuNP）,用于活细胞内耐药相关mRNA的协同抑制及原位成像。MBs-AuNP由两部分构成:（ⅰ）三种特殊设计的分子信标修饰到AuNP表面,用于结合耐药相关的mRNAs,装载Dox并输出荧光信号;（ⅱ）AuNP,用于装载MBs,介导MBs进入细胞并淬灭荧光。被细胞摄取后,MBs-AuNP与三种不同的耐药相关 mRNA（MDR1 mRNA、MRP1 mRNA 和 BCRP mRNA）杂交,通过抑制mRNAs的翻译过程来减少外排蛋白的表达,同时,被AuNP淬灭的荧光团远离金纳米粒,荧光恢复,实现mRNAs的原位成像。实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白印迹结果表明,经MBs-AuNP处理后耐药肿瘤细胞内耐药相关mRNA和外排蛋白的表达均有所下降。与游离Dox相比,Dox-MBs-AuNP对HepG2/ADR（IC50:0.35 vs 1.06μM）和 MCF-7/ADR（IC50:2.78 vs>5μM）具有更好的细胞毒性。通过荧光成像分析可直接观察细胞内杂交事件并实现耐药和非耐药肿瘤细胞的区分。该纳米载体能够通过基因沉默来下调多种外排蛋白的表达,实现对沉默事件的原位监测,提供了一种从基因水平应对药物耐受性的策略。第四章,构建了一种端粒酶特异性的DNAzyme驱动的DNA walker作为纳米载体（tsDNA-AuNP）用于细胞内端粒酶的活性分析及药物递送。该纳米载体由三部分构成:（ⅰ）AuNP,用于装载DNA并淬灭荧光;（ⅱ）行走链,由端粒酶引物和含DNAzyme序列的发卡结构杂交而成,用于结合端粒酶及切割底物发卡;（ⅲ）含有DNAzyme切割位点的底物发卡,用于装载阿霉素并输出荧光信号。该纳米载体内化入胞后,端粒酶引物在端粒酶的作用下发生延伸,打开含DNAzyme序列的发卡结构,释放被封闭的DNAzyme序列,然后行走链沿着三维的轨道运动,在外加Mn2+的作用下切割含DNAzyme切割位点的底物发卡,输出荧光信号并释放阿霉素,随后进行下一轮的切割反应。该方法能够实现低至10个HeLa细胞中端粒酶活性的检测,通过荧光成像的方法能够实现肿瘤细胞和正常细胞的区分,此外,该核酸纳米载体也能够用于端粒酶抑制剂的筛选。第五章为结论部分,主要总结了本论文的创新点及前景展望。
张鑫泽[6]（2020）在《萝卜蚜端粒逆转录酶TERT基因克隆及功能探究》文中指出萝卜蚜Lipaphis erysimi（Kaltenbach）是危害十字花科蔬菜的农业昆虫之一,且繁殖速度快、全球各地均有分布。而端粒逆转录酶TERT是端粒酶中具有催化活性的亚单位,该基因不仅可以诱导端粒酶活性影响细胞衰老、凋亡,还具有除依赖端粒酶以外的其他生物学功能。本研究以萝卜蚜为研究对象,利用基因扩增、RNAi技术、转录组测序及q RT-PCR等方法克隆得到了萝卜蚜端粒酶TERT基因的CDS序列,在m RNA水平上检测了不同处理下TERT基因表达量的动态变化规律,并通过RNAi技术初步探究了TERT基因在萝卜蚜生长发育中的功能,为萝卜蚜的综合防治提供了新的理论依据,主要结论如下:1.根据本地转录组库筛选得到萝卜蚜TERT基因的相关序列,利用基因扩增手段克隆得到了TERT基因的CDS序列。该基因的CDS区全长序列长度为2658 bp,能够编码885个氨基酸残基,其二级结构含41个α-螺旋,60个卷曲螺旋并得到了5种预测的三级结构模型。将其上传至NCBI后比对发现,该基因与麦双尾蚜Diuraphis noxia同源性最高,与其他物种同源性较低。2.利用实时荧光定量PCR技术分析了TERT基因在萝卜蚜不同龄期及不同组织内的相对表达量变化情况。结果显示,萝卜蚜成虫期TERT基因的相对表达量最高,与各龄期均有显着性差异;1龄若虫的表达量显着低于成虫的表达量,但显着高于2龄、3龄、4龄若虫的表达量;4龄若虫表达量最低,但与2龄、3龄若虫的表达量无显着性差异。随后选取发育基本成熟且TERT基因表达量最低的4龄萝卜蚜若虫进行解剖,能够同时在4龄萝卜蚜的头部、胸部、腹部检测到TERT基因的表达,且腹部表达量最高。3.选取2段不同长度的TERT基因不同序列利用RNAi技术对萝卜蚜进行功能探究。研究发现,RNA干扰24 h后,处理组TERT基因的相对表达量分别下调了40.6%和41.3%,均与对照组有显着性差异,且两个不同干扰长度的处理组之间的下调水平并无差异。RNA干扰48 h后,处理组TERT基因相对表达量分别显着下调了73.9%和57.0%,干扰TERT基因片段2的处理组与对照组有显着性差异。RNA干扰72 h后,处理组TERT基因的相对表达量分别下调了69.0%和48.2%,均与对照组有显着性差异,且两个不同干扰长度的处理组之间的下调水平并无差异。生物测试实验结果表明,干扰萝卜蚜TERT基因能够显着提高死亡率,延长发育历期,降低体长、产仔率以及成虫寿命。4.将干扰TERT及EGFP基因72 h后的萝卜蚜,通过Illumina平台进行转录组测序。共得到平均数目为51,190,754及461,296,156条的Cleaning Reads,通过组装得到92371条Unigene序列,平均长度为766 bp。GO注释显示,分子功能类条目注释所占比例最高,其中与ATP结合有关基因注释最多,含4320条序列占8.8%。KEGG注释显示,人类疾病相关条目最多,其中与癌症通路有关的基因注释比例最高,含644条序列占4.9%。KOG注释显示,除了功能未知一类,占比例最大的为信号转导机制条目占全部基因注释的13%。随后选取校正后的P值（FDR）作为筛选差异基因的关键指标,通过筛选一共得到545个差异基因,其中165个基因表达上调,380个基因表达下调。GO分析表明,TERT基因经RNA干扰后抑制了与细胞、有机物、高级分子等相关通路的合成及代谢过程。KEGG分析表明,TERT基因经RNA干扰后诱导了核糖体合成、氧化磷酸化、肌动蛋白细胞骨架调节等相关通路基因的下调。
杨梦雪[7]（2020）在《PinX1基因靶向端粒酶诱导鼻咽癌细胞自噬效应的实验研究》文中认为第一部分PinX1基因调控端粒酶活性对鼻咽癌细胞自噬效应的影响目的:探究PinX1靶向端粒酶对鼻咽癌细胞自噬效应及增殖的影响。方法:通过qPCR和Western blot监测CNE2、6-10B细胞系中PinX1的表达。低表达细胞系转染PinX1过表达质粒及空载质粒并分组,RT-PCR监测各组hTERT mRNA表达,Western blot和免疫荧光监测自噬。CCK-8、transwell小室监测细胞增殖、迁移和侵袭能力,流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡。结果:1.PinX1在CNE2细胞中低表达,在6-10B细胞中高表达。2.CNE2细胞中导入PinX1过表达质粒后,hTERT表达降低。3.CNE2细胞中LC3Ⅰ、P62表达较高,LC3Ⅱ、Beclin1表达较低,自噬流形成较弱,自噬水平较低。细胞的增殖、侵袭迁徙能力较强。4.CNE2细胞中PinX1过表达后LC3Ⅰ、P62表达降低,LC3Ⅱ、Beclin1表达升高,自噬流形成增强,自噬水平增高。细胞的增殖、侵袭和迁徙能力均降低,细胞周期阻滞在G0/G1期,凋亡指数增加。结论:CNE2鼻咽癌细胞自噬表达较低,加入PinX1靶向端粒酶后,鼻咽癌细胞的自噬效应增强,增殖、迁徙和侵袭能力降低,凋亡增加。第二部分PinX1基因调控端粒酶介导鼻咽癌细胞自噬效应的分子机制研究目的:探究PinX1靶向端粒酶诱导鼻咽癌细胞自噬的分子机制。方法:在CNE2细胞中转染PinX1过表达质粒及空载质粒,并在PinX1过表达组加入3-MA。Western blot和免疫荧光监测自噬,CCK8、transwell小室监测细胞增殖、迁移和侵袭能力,流式细胞术分析凋亡情况,Western blot监测各组p65和p-p65的表达。在PinX1过表达组加入氯喹,分析各组p-AKT、p-mTOR的表达。结果:1.PinX1 过表达组加入 3-MA 后,LC3II、Beclin1 表达降低,LC3I、P62表达升高,自噬流形成减弱。细胞增殖、迁移和侵袭能力增强,凋亡指数降低。2.p65和p-p65在CNE2中高表达,PinX1过表达组低表达,加入3-MA后,其表达增高。3.p-AKT、p-mTOR在CNE2中升高,PinX1过表达组降低。加入氯喹后,p-AKT、p-mTOR表达无明显变化,自噬流形成减弱。结论:PinX1靶向端粒酶可能通过AKT/mTOR信号通路诱导鼻咽癌细胞发生自噬效应。此外,自噬效应的增强促进了鼻咽癌细胞凋亡,并通过NF-κB/P65发挥作用。第三部分PinX1靶向端粒酶对鼻咽癌裸鼠移植瘤生长的影响目的:裸鼠成瘤实验监测PinX1对鼻咽癌细胞生长的影响。方法:将空白CNE2、转染空载质粒及PinX1过表达质粒的CNE2分别接种至三组裸鼠,并绘制瘤体的生长-时间曲线。剥离瘤体后行HE染色及免疫组化检测PinX1表达。结果:1.PinX1过表达组的裸鼠瘤体的生长受到了明显抑制。2.各组瘤体的HE切片细胞核均表现出异型性,免疫组化发现PinX1过表达组瘤体中PinX1的表达显着高于其他两组。结论:PinX1靶向端粒酶显着抑制了鼻咽癌裸鼠移植瘤的生长,为鼻咽癌的靶向治疗提供了理论基础。
丁雪鹿[8]（2020）在《胶质母细胞瘤中人端粒酶逆转录酶（hTERT）对自噬水平调控的研究》文中指出目的:胶质母细胞瘤（GBM）是成人最常见、最具进击性的恶性脑肿瘤,伴随着高发病率和高死亡率。尽管医疗技术水平在不断完善,病人可以得到最积极的治疗,但由于肿瘤细胞的高度侵袭能力,使得完整的外科切除手术难以实现,导致患者预后情况并不理想。人端粒酶逆转录酶（hTERT）作为端粒酶的核心催化成分,在大多数肿瘤中都高表达,包括胶质母细胞瘤。除了能够延长端粒使细胞永生化这一经典作用外,hTERT还具有其他非依赖于端粒的功能。自噬是细胞的一种自我保护机制,当细胞处于应激状态下,通过自噬过程,细胞能够将自身受损的胞质有机物质或细胞器运输至溶酶体进行消化降解,并且将其重新利用。有研究表明,当细胞内活性氧（ROS）水平升高时,自噬过程会被激活,从而促进积聚的ROS的清除。反之,自噬过程被破坏,会导致ROS水平的紊乱,进而对细胞的生长增殖情况造成影响。因此,本文将探讨胶质母细胞瘤中hTERT与自噬之间的关系,以及对细胞的ROS及生长增殖情况的影响,为以后的临床治疗提供更多的分子依据。方法:首先,通过对数据库进行挖据,对比hTERT在人类胶质母细胞瘤样本和在正常样本中的表达情况,以及hTERT的不同表达水平对胶质母细胞瘤病人生存期的影响。然后,利用携带sh RNA的慢病毒感染U87胶质母细胞瘤细胞,构建稳定敲低hTERT蛋白的细胞系。采用克隆形成和细胞增殖实验检测hTERT对细胞增殖的影响;采用蛋白质免疫印迹法探讨hTERT与细胞自噬水平的关系。接着,采用荧光探针检测分析hTERT对ROS水平的调控作用,并通过抗氧化剂处理细胞检测细胞活力。最后,对自噬基因进行过表达,检测hTERT、自噬与细胞ROS水平之间的关系,并通过细胞活力检测分析hTERT表达、自噬及ROS水平对细胞活力的影响。结果:1、生物信息学分析结果表明hTERT的mRNA水平在胶质母细胞瘤中的表达较正常组织表达高,并且hTERT高表达的患者生存率较低。体外生物学实验表明hTERT敲低会引起胶质母细胞瘤细胞死亡,并且能明显降低细胞的生长与增殖。2、hTERT缺失能够抑制自噬的发生,进而导致胶质母细胞瘤细胞内ROS水平的增加,并对细胞的活力造成影响。3、在hTERT缺失的细胞中过表达自噬相关基因BECN1能够恢复自噬的发生,降低细胞内ROS的水平,并且恢复细胞活力。结论:生物信息学分析和生物学实验都表明,hTERT在胶质母细胞瘤的生长过程中扮演着重要角色。体外的生物学实验表明,除了经典的延伸端粒长度的作用外,hTERT还能够通过BECN1的介导诱导自噬的发生,降低胶质母细胞瘤ROS的水平,进而调控细胞的生长,为hTERT作为肿瘤临床治疗的一个有效靶点提供了更多的分子依据。
沈海龙[9]（2020）在《TERT在喉癌组织中的免疫组化表达及其临床意义》文中研究表明目的喉癌是一种常见的头颈部恶性肿瘤,喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC）占喉癌的90%以上。喉癌的5年生存率在过去40年里从66%下降到63%,因此对于喉癌的早期诊断和治疗十分重要。喉癌的特定生物标志物有助于喉癌的诊断、治疗及判断预后,但目前仍缺乏临床上广泛认可和使用的生物标志物。我们想要评估端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase,TERT）在LSCC中的表达及其与肿瘤侵袭和淋巴结转移的关系,以求发现新的喉癌标志物。方法我们收集了从2011年3月5日至2013年12月20在安徽医科大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科手术的64位经病理确诊为喉癌患者的标本。我们共收集了64例喉癌组织及其对应的癌旁组织。通过免疫组织化学方法检测TERT蛋白在喉癌组织及癌旁组织中的表达状况,采用Image-Pro Plus 6.0软件计算细胞染色强度的平均光密度值,在选定的面积一定时,平均光密度值越大,表示蛋白表达越强。用SPSS19.0分析TERT在不同组别中的表达差异,并根据对患者的5年随访情况进行生存分析。结果我们发现TERT蛋白主要在细胞质中表达,表现为棕黄色颗粒弥漫性分布,同时在细胞核中也有少量表达。TERT在喉癌组织中的表达强度明显高于对应的癌旁组织,差异有统计学意义（t=16.58,p<0.05）;喉癌组织中吸烟组TERT表达水平高于不吸烟组,差异具有统计学意义（t=2.06,p<0.05）;喉癌组织中饮酒组TERT表达水平高于不饮酒组,差异具有统计学意义（t=2.66,p<0.05）;喉癌组织中高分化组、中分化组和低分化组的TERT表达量逐渐增高,三个组别之间的差异具有统计学意义（F=20.50,p<0.05）;喉癌组织中临床分期为III+IV期组的TERT表达量明显高于I+II期组,二者差异具有统计学意义（t=5.22,p<0.05）;喉癌组织中淋巴结转移阳性组TERT表达水平明显高于淋巴结转移阴性组,二者差异具有统计学意义（t=6.88,p<0.05）。用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,TERT表达≥P50的死亡率（78.18%）明显高于TERT表达<P50（25.95%）的死亡率,差异有统计学意义（x2=18.33,P<0.0001）。Cox多因素分析显示TERT表达强度大于第50百分位数和复发是喉癌患者预后的独立的影响因素。结论1、在喉癌组织中,TERT蛋白的表达强度高于癌旁组织,提示TERT与喉鳞状细胞癌的发生有关。2、TERT的表达水平与喉癌患者的的吸烟史、饮酒史、临床分期、组织学分级以及淋巴结转移有关,提示TERT的过度表达与肿瘤的侵袭与转移有关。3、TERT过度表达的喉癌患者的生存率低于表达强度较低的患者,提示TERT的表达与喉癌患者的预后相关。4、在临床工作中,对TERT含量进行测定,可能有助于对喉癌的早期诊断、治疗和判断预后,TERT有望成为广泛使用的喉癌标志物和喉癌靶向治疗的新靶点。
刘雪雯[10]（2019）在《胃癌中BRM对hTERT选择性剪接和端粒酶活性的调节》文中研究表明研究目的胃癌是一种高发的恶性肿瘤,是所有肿瘤病死率的第三位,给人类健康造成了巨大的威胁,引起了沉重的疾病负担。随着医疗技术的不断进步,胃癌的5年存活率有所提升,但是依然不容乐观。胃癌的发生发展过程中涉及多种因素,包括环境因素和遗传因素等。SWI/SNF复合物是一种ATP酶依赖的染色质重塑复合物,其核心的ATP酶亚基有两种,BRM和BRG1。在多种肿瘤包括胃癌的组织和细胞系中有BRM蛋白水平的下调,说明除了ATP酶活性功能,BRM蛋白可能有抑制肿瘤的作用。有研究表明BRM作为一种选择性剪接调控因子,参与调控其他肿瘤相关蛋白的表达,进而影响肿瘤的发生发展。人端粒酶逆转录酶（hTERT）是端粒酶的核心催化亚基,是肿瘤细胞的一种标志物,hTERT的前体mRNA会发生选择性剪接,产生多种选择性剪接转录本,但是这些选择性剪接转录本都不能翻译成有逆转录酶活性的hTERT蛋白。因此本研究的目的是探究胃癌中BRM蛋白对hTERT选择性剪接模式和端粒酶活性的影响,为肿瘤的靶向治疗提供新的方向和证据。研究方法本课题主要分为两个部分:第一部分,采用生物信息学的方法,调用多种数据库分析BRM和BRG1在细胞中的分布,在人类正常组织和肿瘤组织中的表达水平,与胃癌病人的生存分析,与胃癌中幽门螺杆菌感染的相关性,相互作用基因以及GO分析和通路富集分析。第二部分,进行生物学试验,用携带shRNA的慢病毒载体感染胃癌细胞系,稳定敲低胃癌细胞中的BRM,利用逆转录PCR,蛋白免疫印迹,端粒重复序列扩增法（TRAP）,克隆形成和RNA-Seq等方法检测BRM敲低对hTERT的选择性剪接模式,端粒酶活性和细胞增殖的影响,探讨BRM在肿瘤中的作用。研究结果第一部分:生物信息学分析结果显示BRM均匀分布在细胞质和细胞核中,BRG1主要分布在细胞核中;在人类正常组织中BRM和BRG1的mRNA和蛋白都有广泛的表达;BRM高表达的胃癌患者生存期相对较长,而BRG1低表达的胃癌患者生存期相对较长,可能代表了BRM和BRG1在胃癌的进展过程中有不同的作用;在无感染幽门螺旋杆菌感染的胃癌患者中BRM和BRG1表达量较多且易发生突变,在有幽门螺旋杆菌感染的胃癌患者中BRM和BRG1表达量较少;得到BRM的相互作用基因133个,BRG1的相互作用基因213个,有64个基因是二者的相互作用基因重合的部分,二者的相互作用基因主要富集在肿瘤相关的信号通路中,提示BRM和BRG1在肿瘤的发生发展中可能起着重要的作用。第二部分:采用携带shRNA的慢病毒载体感染胃癌细胞系构建BRM稳定敲低的细胞系,逆转录PCR检测hTERT前体mRNA的选择性剪接模式,结果显示,BRM敲低的细胞中全长型转录本的表达水平显着升高,之后用TRAP方法检测了端粒酶活性,结果显示BRM敲低的细胞中的端粒酶活性也出现了显着升高,这提示BRM可以通过调控hTERT的选择性剪接模式进而影响端粒酶活性。研究结论一、生物信息学分析的结果表明,BRM和BRG1可能参与胃癌的发生发展,并且可能具有不同的作用。二、生物学实验的结果显示,BRM的敲低可以影响hTERT的选择性剪接模式和端粒酶活性,表明BRM是hTERT选择性剪接的一个调控因子,有望开发作为肿瘤治疗的一个靶点。
二、恶性肿瘤端粒酶逆转录酶基因的表达及调控研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、恶性肿瘤端粒酶逆转录酶基因的表达及调控研究进展（论文提纲范文）
（1）人端粒酶逆转录酶hTERT鉴别乳腺良恶性肿瘤的Meta分析（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 资料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述:人端粒酶逆转录酶h TERT在乳腺肿瘤诊断治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的文章 |
（2）外周血白细胞端粒长度与端粒酶活性对非小细胞肺癌患者预后的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 端粒长度、端粒酶与非小细胞肺癌患者预后相关性研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）基于PI3K/AKT/mTOR信号通路和端粒酶逆转录酶靶标的小分子药物的设计、合成及构效研究（论文提纲范文）
| 专用词缩写表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 基于PI3K/AKT/mTOR信号通路紫草素衍生物的设计合成及抗肿瘤活性测试 |
| 1 前言 |
| 2 目标化合物的设计 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 试剂和仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 细胞培养 |
| 3.4 细胞增殖实验 |
| 3.5 细胞周期检测试验 |
| 3.6 细胞凋亡实验 |
| 3.7 集落克隆实验 |
| 3.8 酸性囊泡检测试验 |
| 3.9 GFP-LC3 转染实验 |
| 3.10 免疫荧光检测LC3 |
| 3.11 Western Blot分析 |
| 3.12 统计分析 |
| 4 实验结果 |
| 5 结论 |
| 第二章 新型端粒酶逆转录酶嘧啶类抑制剂的设计、合成及活性构效关系研究 |
| 1 前言 |
| 2 目标化合物的设计 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 试剂和仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 细胞培养 |
| 3.4 CCK-8 细胞增殖实验 |
| 3.5 端粒酶活性检测实验 |
| 3.6 细胞周期检测试验 |
| 3.7 细胞凋亡实验 |
| 3.8 分子对接方法 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 单晶数据解析 |
| 4.2 抗增殖活性分析 |
| 4.3 细胞周期结果分析 |
| 4.4 细胞凋亡实验分析 |
| 4.5 分子对接结果分析 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附图:部分中间体和产品谱图 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 小分子端粒酶抑制剂研究进展 |
| 参考文献 |
（4）肾细胞癌组织中hTERT启动子甲基化水平与其临床病理意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 人TERT启动子甲基化水平及其与肾细胞癌病理特征的关系研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 人hTERT启动子甲基化水平等影响肾细胞癌预后的多因素分析 |
| 前言 |
| 对象与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 综述 肾癌DNA甲基化研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 附英文文章 |
（5）新型核酸纳米载体的设计及在肿瘤细胞成像和药物递送中的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号与缩写 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 癌症的诊断与治疗 |
| 1.1.1 癌症的诊断 |
| 1.1.2 癌症的治疗 |
| 1.1.3 癌症的诊疗一体化 |
| 1.2 经典的核酸结构单元用于设计纳米载体 |
| 1.2.1 核酸适配体 |
| 1.2.2 脱氧核酶 |
| 1.2.3 分子信标 |
| 1.2.4 双链探针 |
| 1.3 金纳米颗粒 |
| 1.3.1 金纳米颗粒的理化性质 |
| 1.3.2 金纳米颗粒分布、代谢性质和毒理研究 |
| 1.3.3 金纳米颗粒在癌症诊疗中的应用研究 |
| 1.4 核酸纳米载体在癌症诊断和治疗中的研究进展 |
| 1.4.1 具有荧光特性的核酸纳米探针用于肿瘤细胞成像 |
| 1.4.2 核酸纳米载体在药物递送中的研究 |
| 1.4.3 基于核酸纳米载体的癌症诊疗一体化研究 |
| 1.5 本论文解决的科学问题及研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 内源性刺激响应核靶向的纳米载体用于细胞内mRNA成像及药物递送 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂和仪器 |
| 2.2.2 凝胶电泳实验 |
| 2.2.3 金纳米颗粒(AuNPs)的合成及AuNP-mRS-DSs的制备 |
| 2.2.4 金纳米颗粒表面mRS-DS的修饰量考察 |
| 2.2.5 特异性考察 |
| 2.2.6 杂交实验 |
| 2.2.7 细胞系及细胞培养 |
| 2.2.8 细胞内荧光成像实验 |
| 2.2.9 qRT-PCR对MRP1 mRNA进行分析 |
| 2.2.10 细胞摄取 |
| 2.2.11 阿霉素插入实验 |
| 2.2.12 细胞存活率考察 |
| 2.2.13 统计学分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 DNA序列设计的可行性验证 |
| 2.3.2 AuNP-mRS-DSs的表征 |
| 2.3.3 金纳米颗粒表面mRS-DS的修饰量及AuNP-mRS-DSs的特异性考察 |
| 2.3.4 AuNP-mRS-DSs的选择性考察 |
| 2.3.5 细胞内荧光成像 |
| 2.3.6 细胞摄取 |
| 2.3.7 纳米载体的载药量考察 |
| 2.3.8 细胞存活率考察 |
| 2.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 多功能分子信标修饰的金纳米颗粒作为纳米载体用于活细胞内耐药相关mRNA的协同抑制及原位成像 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂和仪器 |
| 3.2.2 凝胶电泳实验 |
| 3.2.3 金纳米颗粒(AuNPs)的合成及MBs-AuNP的制备 |
| 3.2.4 金纳米颗粒表面分子信标的修饰量考察 |
| 3.2.5 可行性与稳定性实验 |
| 3.2.6 细胞系及细胞培养 |
| 3.2.7 细胞内荧光成像 |
| 3.2.8 MDR1 mRNA、MRP1 mRNA和BCRP mRNA的相对表达水平分析 |
| 3.2.9 Western blotting实验 |
| 3.2.10 阿霉素插入实验 |
| 3.2.11 细胞毒性实验 |
| 3.2.12 统计学分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 DNA序列设计的可行性验证 |
| 3.3.2 MBs-AuNP的表征 |
| 3.3.3 金纳米颗粒表面分子信标的修饰量考察 |
| 3.3.4 可行性及稳定性考察 |
| 3.3.5 细胞内荧光成像 |
| 3.3.6 MBs-AuNP对细胞内耐药相关mRNA和蛋白水平的影响 |
| 3.3.7 纳米载体的载药量考察 |
| 3.3.8 细胞存活率实验 |
| 3.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 端粒酶特异性的DNAzyme驱动的DNA walker作为纳米载体用于活细胞内端粒酶活性分析及药物递送 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂和仪器 |
| 4.2.2 凝胶电泳实验 |
| 4.2.3 金纳米颗粒(AuNPs)的制备 |
| 4.2.4 tsDNA-AuNP的制备及其表面底物发卡修饰量的考察 |
| 4.2.5 细胞培养及HeLa细胞提取液的制备 |
| 4.2.6 HeLa细胞提取液中端粒酶活性检测 |
| 4.2.7 tsDNA-AuNP的稳定性考察 |
| 4.2.8 细胞内端粒酶活性的成像分析 |
| 4.2.9 TERT mRNA的相对表达水平分析 |
| 4.2.10 端粒酶抑制剂的筛选 |
| 4.2.11 阿霉素插入实验 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 DNA序列设计的可行性验证 |
| 4.3.2 tsDNA-AuNP的表征 |
| 4.3.3 tsDNA-AuNP的可行性和稳定性考察 |
| 4.3.4 行走链与底物发卡修饰比例的考察 |
| 4.3.5 tsDNA-AuNP检测性能的考察 |
| 4.3.6 细胞内端粒酶活性分析的条件优化 |
| 4.3.7 不同细胞内端粒酶活性分析 |
| 4.3.8 端粒酶抑制剂的筛选 |
| 4.3.9 纳米载体的载药量考察 |
| 4.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 博士期间发表论文 |
| 附录 |
| 附件 |
（6）萝卜蚜端粒逆转录酶TERT基因克隆及功能探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1.前言 |
| 1.1 萝卜蚜概述 |
| 1.1.1 萝卜蚜形态特征 |
| 1.1.2 萝卜蚜生活习性 |
| 1.1.3 萝卜蚜危害 |
| 1.1.4 萝卜蚜综合防治 |
| 1.2 端粒和端粒逆转录酶 |
| 1.2.1 端粒结构与概念 |
| 1.2.2 端粒功能 |
| 1.2.3 端粒酶结构与概念 |
| 1.2.4 端粒酶功能 |
| 1.2.5 端粒逆转录酶TERT基因功能研究 |
| 1.2.6 端粒及端粒酶在昆虫中的研究 |
| 1.3 RNA干扰(RNA inference)简介 |
| 1.3.1 RNAi发现历史 |
| 1.3.2 RNAi的作用机制 |
| 1.4 RNA干扰的常用方法 |
| 1.4.1 显微注射法 |
| 1.4.2 浸泡法 |
| 1.4.3 饲喂法 |
| 1.5 RNAi技术在昆虫学研究中的研究进展 |
| 1.5.1 昆虫中基因功能的研究 |
| 1.5.2 害虫防治 |
| 1.6 本研究的目的意义及创新点 |
| 1.6.1 本研究的目的意义 |
| 1.6.2 本研究创新点 |
| 1.7 研究内容与技术路线 |
| 1.7.1 研究内容 |
| 1.7.2 技术路线 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试昆虫 |
| 2.1.2 供试仪器 |
| 2.1.3 供试试剂及缓冲液配制 |
| 2.1.4 供试引物序列 |
| 2.2 萝卜蚜TERT基因克隆及生物信息学分析 |
| 2.2.1 基因检测样品收集 |
| 2.2.2 萝卜蚜总RNA提取(Trizol法) |
| 2.2.3 cDNA合成 |
| 2.2.4 端粒逆转录酶TERT基因CDS序列克隆 |
| 2.2.5 端粒逆转录酶TERT基因生物信息学分析 |
| 2.3 萝卜蚜TERT基因时间及时空表达 |
| 2.3.1 基因检测样品收集 |
| 2.3.2 萝卜蚜总RNA提取(Trizol法) |
| 2.3.3 cDNA合成 |
| 2.3.4 实时荧光定量PCR分析TERT表达量 |
| 2.4 萝卜蚜端粒逆转录酶TERT基因RNAi研究 |
| 2.4.1 dsRNA表达载体的构建 |
| 2.4.2 dsRNA表达检测 |
| 2.4.3 dsRNA表达纯化 |
| 2.4.4 dsRNA降解情况检测 |
| 2.4.5 萝卜蚜dsRNA饲喂和生物测定 |
| 2.4.6 利用q RT-PCR检测RNA干扰效率 |
| 2.5 转端粒逆转录酶TERT基因拟南芥构建 |
| 2.5.1 转基因表达载体构建 |
| 2.5.2 转基因表达载体检测 |
| 2.5.3 转基因拟南芥的构建 |
| 2.5.4 阳性植株筛选及PCR检测 |
| 2.6 RNA干扰后萝卜蚜转录组分析 |
| 2.6.1 转录组样品收集 |
| 2.6.2 Illumina测序和序列组装 |
| 2.6.3 Unigene功能注释 |
| 2.6.4 基因表达差异分析 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 萝卜蚜端粒逆转录酶TERT基因生物信息学分析 |
| 3.1.1 萝卜蚜端粒酶TERT基因PCR扩增检测 |
| 3.1.2 萝卜蚜TERT基因编码氨基酸残基序列 |
| 3.1.3 萝卜蚜TERT二级结构预测 |
| 3.1.4 萝卜蚜TERT三级结构预测 |
| 3.1.5 萝卜蚜TERT基因同源性比对 |
| 3.1.6 萝卜蚜TERT基因系统发育树构建 |
| 3.2 萝卜蚜TERT基因时间及时空表达检测 |
| 3.2.1 端粒逆转录酶TERT基因在萝卜蚜不同龄期的表达分析 |
| 3.2.2 端粒逆转录酶TERT基因在萝卜蚜不同组织的表达分析 |
| 3.3 沉默TERT基因对萝卜蚜生长发育的影响 |
| 3.3.1 TERT基因的ds RNA表达载体的构建 |
| 3.3.2 Pet-2p-TERT的 ds RNA的表达检测及纯化 |
| 3.3.3 dsRNA降解情况检测 |
| 3.3.4 TERT基因沉默24-72 h后的m RNA表达水平 |
| 3.3.5 TERT基因沉默对萝卜蚜生长发育的影响 |
| 3.4 转TERT基因拟南芥的构建 |
| 3.4.1 转基因拟南芥载体检测 |
| 3.4.2 转基因拟南芥阳性植株筛选 |
| 3.5 RNA干扰后萝卜蚜转录组分析 |
| 3.5.1 RNA完整性检测 |
| 3.5.2 RNA文库检测和定量 |
| 3.5.3 萝卜蚜转录组序列分析和组装 |
| 3.5.4 基因功能注释 |
| 3.5.5 GO分类 |
| 3.5.6 KEGG注释 |
| 3.5.7 KOG注释 |
| 3.5.8 差异表达基因的筛选 |
| 3.5.9 差异表达基因GO和 KEGG富集分析 |
| 3.5.10 分析探究TERT基因调控差异基因表达 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（7）PinX1基因靶向端粒酶诱导鼻咽癌细胞自噬效应的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 PinX1基因调控端粒酶活性对鼻咽癌细胞自噬效应的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 实验结论 |
| 第二部分 PinX1基因调控端粒酶活性介导鼻咽癌细胞自噬效应的分子机制研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 实验结论 |
| 第三部分 PinX1靶向端粒酶对鼻咽癌裸鼠移植瘤生长的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读学位期间参与发表的学术论文 |
| 致谢 |
（8）胶质母细胞瘤中人端粒酶逆转录酶（hTERT）对自噬水平调控的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、hTERT在胶质母细胞瘤中的表达及对其生存的影响 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要溶液的配制 |
| 1.1.5 研究方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 hTERT在正常组织和癌组织中的mRNA水平 |
| 1.2.2 hTERT在胶质母细胞瘤患者中的生存分析 |
| 1.2.3 sh RNA病毒敲低hTERT的效果 |
| 1.2.4 hTERT敲低对细胞生长增殖的影响 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、自噬及ROS参与hTERT对胶质母细胞瘤生长增殖的调控 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 实验方法及主要流程 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 hTERT敲低对细胞自噬水平的影响 |
| 2.2.2 hTERT敲低对细胞内ROS水平的影响 |
| 2.2.3 ROS参与hTERT对细胞活力的调控 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、hTERT通过BECN1的介导调控自噬和ROS水平 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验对象 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要溶液的配制 |
| 3.1.5 实验方法及主要流程 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 过表达BECN1能够恢复hTERT缺失对自噬的削弱作用 |
| 3.2.2 过表达BECN1能够恢复hTERT缺失对ROS水平的影响 |
| 3.2.3 过表达BECN1能够改善hTERT缺失对细胞生长的抑制作用 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 端粒酶逆转录酶(TERT)的神经保护作用 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）TERT在喉癌组织中的免疫组化表达及其临床意义（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1.前言 |
| 2.资料与方法 |
| 2.1 临床资料及标本来源 |
| 2.2 实验试剂及设备 |
| 2.3 实验步骤 |
| 2.3.1 蜡块制作 |
| 2.3.2 免疫组化 |
| 2.4 免疫组化定量分析 |
| 2.5 病例随访情况 |
| 2.6 数据分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 研究对象的临床特征 |
| 3.2 TERT的免疫组化表达 |
| 3.3 生存分析 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 附录 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 喉鳞状细胞癌生物标志物的研究进展 |
| 参考文献 |
（10）胃癌中BRM对hTERT选择性剪接和端粒酶活性的调节（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、生物信息学方法研究SMARCA2和SMARCA4 的表达 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 研究方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 SMARCA2和SMARCA4 在细胞中的分布和组织中的表达 |
| 1.2.2 SMARCA2和SMARCA4 与胃癌患者的的生存分析 |
| 1.2.3 SMARCA2和SMARCA4 与幽门螺杆菌感染的相关性 |
| 1.2.4 SMARCA2和SMARCA4 的相互作用基因和富集分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、胃癌中BRM缺失对hTERT选择性剪接及端粒酶活性的影响 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要耗材 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要溶液的配制 |
| 2.1.6 引物及序列 |
| 2.1.7 实验方法和流程 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 shRNA敲低BRM的效果 |
| 2.2.2 BRM敲低对hTERT选择性剪接模式的影响 |
| 2.2.3 BRM敲低对端粒酶活性和细胞增殖的影响 |
| 2.2.4 BRM敲低的RNA测序分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 hTERT前体mRNA选择性剪接的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、恶性肿瘤端粒酶逆转录酶基因的表达及调控研究进展（论文参考文献）
- [1]人端粒酶逆转录酶hTERT鉴别乳腺良恶性肿瘤的Meta分析[D]. 唐铃丰. 重庆医科大学, 2021(01)
- [2]外周血白细胞端粒长度与端粒酶活性对非小细胞肺癌患者预后的影响[D]. 刘德豪. 承德医学院, 2021(01)
- [3]基于PI3K/AKT/mTOR信号通路和端粒酶逆转录酶靶标的小分子药物的设计、合成及构效研究[D]. 沈晓宝. 安徽医科大学, 2021(01)
- [4]肾细胞癌组织中hTERT启动子甲基化水平与其临床病理意义[D]. 郑建波. 山东大学, 2020(01)
- [5]新型核酸纳米载体的设计及在肿瘤细胞成像和药物递送中的应用研究[D]. 刘晓亭. 山东大学, 2020(08)
- [6]萝卜蚜端粒逆转录酶TERT基因克隆及功能探究[D]. 张鑫泽. 华中农业大学, 2020(02)
- [7]PinX1基因靶向端粒酶诱导鼻咽癌细胞自噬效应的实验研究[D]. 杨梦雪. 南方医科大学, 2020(01)
- [8]胶质母细胞瘤中人端粒酶逆转录酶（hTERT）对自噬水平调控的研究[D]. 丁雪鹿. 天津医科大学, 2020(06)
- [9]TERT在喉癌组织中的免疫组化表达及其临床意义[D]. 沈海龙. 安徽医科大学, 2020(02)
- [10]胃癌中BRM对hTERT选择性剪接和端粒酶活性的调节[D]. 刘雪雯. 天津医科大学, 2019(02)