一、鸡传染性支气管炎肾型弱毒株J_9的安全性试验（论文文献综述）
陈淑琴[1]（2021）在《GVI-1型传染性支气管炎病毒的RT-qPCR检测方法建立、致病性评价和弱毒疫苗株培育》文中研究指明传染性支气管炎（infectious bronchitis,IB）是鸡的一种急性、病毒性疾病,主要侵害呼吸和泌尿生殖系统。该病在世界范围内广泛流行,给养禽业造成严重的经济损失。传染性支气管炎病毒（IBV）的基因型众多,可分为Ⅰ～Ⅵ群及不同亚群,其中GVI-1基因型（又称TC07-2型）毒株于2007年在我国广东省首次被分离鉴定,随后在亚洲其他一些国家相继出现。流行病学监测显示,近年来GVI-1基因型IBV毒株的分离率持续上升,尤其在中国南方地区更为普遍。本研究建立了 GVI-1型IBV毒株的RT-qPCR检测方法,评价了该型毒株对雏鸡及产蛋鸡的致病性,并且培育了具有良好安全性和免疫保护效果的弱毒疫苗候选株。这对于GVI-1型IBV的监测和防控具有重要意义。1.GVI-1型传染性支气管炎病毒的RT-qPCR检测方法建立为快速鉴别GVI-1基因型IBV毒株与其他基因型IBV毒株,根据不同基因型毒株S1基因序列差异较大的区域设计特异性引物和探针,建立了检测GVI-1基因型毒株的RT-qPCR方法。该方法在1.0×1010～1.0×101拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,相关系数（R2）为0.999;对质粒标准品的检测下限可达1.0×101拷贝/μL;与GI-1、GI-7、GI-13、GI-19和GI-28等其它基因型毒株均无交叉反应;组内和组间重复试验的变异系数均小于2.5%。应用该方法和常规PCR方法对人工感染雏鸡的口腔和泄殖腔拭子进行检测,两者的符合率为96.7%,且RT-qPCR方法的阳性检出率更高。本研究建立的GVI-1基因型IBV RT-qPCR检测方法的灵敏度高,特异性强,可重复性好,对GVI-1基因型IBV的流行病学监测和临床分离株的快速筛查具有重要意义。2.GVI-1型IBV毒株的致病性评价试验一:将80只10日龄的SPF雏鸡（母鸡）随机分为攻毒组和对照组,每组40只。攻毒组每只鸡通过滴鼻点眼接种0.1 mL（106.5EID50）GVI-1基因型IBV CK/CH/JX/2018/1（JX181）毒株,对照组接种等量PBS。每天观察鸡的临床症状,定期剖检,并采集组织样品进行病毒载量的检测和病理组织学检查;定期采集口腔和泄殖腔拭子,进行排毒检测。试验鸡产蛋后,对每天的产蛋数量和蛋品质参数进行记录和测定。180日龄时,对所有实验鸡安乐死并尸检。结果显示,接种GVI-1基因型IBV后雏鸡出现严重的呼吸道症状,喉头气管和法氏囊出血、肺充血及输卵管囊性水肿;组织病变主要发生在攻毒后第6～9天,雏鸡气管纤毛丢失、上皮细胞脱落、黏膜固有层有淋巴细胞浸润,肺支气管出血,脾窦内巨噬细胞数量增多,肾小管上皮细胞肿胀、坏死,法氏囊淋巴滤泡萎缩、间质扩张;GVI-1基因型IBV可在气管、肺、脾、肾和法氏囊等多种组织中复制,以气管的病毒载量最高,口腔和泄殖腔拭子中都可以检测到排毒,且通过口腔排毒量更高,排毒持续时间更长。剖检发现,180日龄时攻毒组母鸡出现卵巢炎症、体腔内有液状卵黄物质或纤维蛋白凝块、输卵管囊肿、输卵管和卵巢发育迟缓;此外攻毒组产蛋量相较对照组下降了 15.1%。结果表明,GVI-1型IBV具有广泛的组织嗜性,母鸡感染后可影响卵巢和输卵管发育,对输卵管造成永久性损伤,造成产蛋量下降。试验二:将8只200日龄产蛋母鸡随机分为攻毒组和对照组,每组4只。攻毒组每只鸡通过滴鼻点眼接种0.1 mL（106.5EID50）GVI-1基因型IBV CK/CH/JX/2018/1（JX181）毒株,对照组接种等量PBS。每天观察鸡的临床症状,对每天的产蛋数量和蛋品质参数进行记录和测定,于攻毒后第4天和第8天每组随机抽取两只鸡进行剖检并采集输卵管漏斗部、膨大部、峡部及子宫部进行病毒载量的检测、病理组织学检查和免疫组织化学分析。结果显示,GVI-1型IBV毒株可引起母鸡呼吸困难、气管啰音等临床症状,导致蛋品质下降,浓蛋白稀薄,血肉斑比例增加,蛋壳变薄等;剖检显示感染母鸡喉头气管出血、肺充血,输卵管黏膜褶皱变平、管壁变薄、管腔内有异物;病理组织学检查显示,攻毒组母鸡输卵管管状腺结构被破坏,管状腺细胞退化,黏膜固有层水肿;病毒可在输卵管的所有节段中复制,复制能力由强到弱依次为输卵管漏斗部、子宫部、峡部和膨大部,与免疫组织化学试验着色强度一致。结果表明,GVI-1型IBV对产蛋母鸡的输卵管具有强烈嗜性,可造成输卵管严重损伤,引起蛋品质降低。3.GVI-1基因型IBV弱毒株的培育及其安全性和免疫效力的初步评价为研发针对GVI-1型IBV的新型弱毒疫苗,将GVI-1型IBV JX181株在SPF鸡胚上进行连续传代,传至5代次、95代次和115代次的毒株分别命名为JXP5株、JXP95株和JXP115株。本研究建立了 JXP5株的攻毒模型,并对JXP95和JXP115的安全性和免疫保护性进行初步评价。JXP5株可引起雏鸡典型的IBV临床症状,对气管、肺、肾、法氏囊和输卵管等组织均可造成损伤,JXP95毒株不引起鸡的临床症状,但可导致喉头轻微出血,气管粘膜固有层增厚和淋巴细胞浸润,肺支气管腔内偶尔有少量红细胞浸润和法氏囊淋巴滤泡间质扩张,而接种JXP115毒株的雏鸡无任何临床症状和肉眼病变,仅可见气管粘膜固有层有少量淋巴细胞浸润。扫描电镜观察显示,JXP5株可导致鸡气管纤毛大面积脱落,JXP95株引起的气管纤毛损伤较轻,而接种JXP115气管纤毛完整。通过RT-qPCR检测各组织中的病毒载量发现,JXP95和JXP115毒株的复制能力显着低于JXP5株。免疫保护性实验显示,JXP95和JXP115毒株免疫组的雏鸡在用JXP5株攻毒时均不出现临床症状,气管纤毛完整、活力良好,而非免攻毒组临床症状严重,气管纤毛脱落、运动停滞;JXP95和JXP115免疫组口腔和泄殖腔的排毒量和排毒持续时间均显着低于未免疫组。上述结果表明,IBV JX181毒株在鸡胚上传至95代次时仍可对雏鸡的组织器官造成轻微损伤,而115代次毒株的致病力充分降低且仍保留良好免疫原性。因此,JXP115是一株良好的GVI-1型IBV弱毒疫苗候选株。
盛洁[2]（2021）在《表达IBV纤突蛋白的ILT重组病毒构建及其免疫效果评价》文中指出鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）引起的一种急性上呼吸道传染病,对全球家禽养殖业危害严重,是目前养禽业面临的最重要疫病之一。有必要基于IBV流行病学研究结果,针对目前我国主要流行的毒株类型研制新型疫苗。纤突（Spike,S）蛋白是IBV病毒粒子表面重要的糖蛋白,在病毒入侵以及受体结合等方面发挥重要作用。纤突蛋白在成熟过程中进一步裂解为S1亚基和S2亚基,其中S1亚基含有病毒主要的中和表位,是IBV重要的免疫原基因,往往将其作为IBV型特异性疫苗设计的主要靶点。鸡传染性喉气管炎（Infectious laryngotracheitis,ILT）是由鸡传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus,ILTV）引起的影响家禽生产的另一大病毒性呼吸道传染病。该病往往呈地方性散发,但近年来国内鸡群频繁暴发ILT,造成较大的经济损失,弱毒疫苗作为防控该病的有效手段,引起养禽业界的重视。ILTV和IBV作为两种重要呼吸道病毒,由于两者对宿主的感染部位和免疫机理相似,研制联合疫苗成为同时防控这两种疫病的迫切需求,ILTV具备作为疫苗载体表达其他病原保护性抗原的潜质。鉴于此,基于ILT弱毒株来构建表达IB重要免疫原基因的重组ILT基因工程载体联合疫苗便成为同时防控IB和ILT两种疫病的最优选择。本研究以ILTV弱毒株CK/CH/LHLJ/120305株为亲本毒株,将其US9基因缺失并插入增强型绿色荧光蛋白表达盒（EGFP）后获得的ILTV突变体ILTV-ΔUS9-G株作为中间病毒,采用基因同源重组技术,将ILTV-ΔUS9-G株病毒的EGFP基因分别替换为IBV GI-19（QX）型强毒株CK/CH/LDL/091022株的S基因和S1基因,获得表达IBV S蛋白的重组病毒ILTV-ΔUS9-S株及表达IBV S1蛋白的重组病毒ILTV-ΔUS9-S1株。两株重组病毒插入的外源基因S基因和S1基因不影响其体外复制能力,且ILTV-ΔUS9-S1株较亲本弱毒CK/CH/LHLJ/120305株复制滴度更高。两株重组病毒在LMH（Leghorn male hepatocellular cell,鸡肝癌细胞系）上连续传代15代,并以本研究制备的抗IBV S1蛋白的单克隆抗体对重组病毒进行间接免疫荧光检测,结果显示,IBV S蛋白和S1蛋白分别在两株重组病毒中能稳定表达,但表达量较低。两株重组病毒接种SPF鸡后,无不良临床反应,说明重组病毒对鸡是安全的。为评价两株重组病毒对ILTV强毒的免疫保护效果,采用间接ELISA对免疫鸡的血清抗体进行检测,结果显示,免疫后7 d两株重组病毒即能诱导鸡只产生高水平的血清抗体,其中ILTV-ΔUS9-S1株诱导产生的抗体水平更高。从ILTV WG株攻毒后的临床表现来看,两株重组病毒免疫组鸡只不表现呼吸道症状,喉头、气管中的病毒载量远低于对照组鸡只,且ILTV-ΔUS9-S株免疫组鸡只的咽拭子攻毒后8 d不再排毒,ILTV-ΔUS9-S1株免疫组攻毒后12 d不再排毒,显示两株重组病毒均能提供针对ILTV强毒株的完全保护。对于重组病毒针对IBV CK/CH/LDL/091022强毒株的免疫保护效果,s Ig A及IFN-γELISpot检测结果显示,两株重组病毒仅能诱导部分鸡只产生有限的特异性粘膜免疫及细胞免疫反应,对免疫后鸡只进行血清抗体检测,显示免疫后两个免疫组仅有部分鸡血清抗体转阳。两株重组病毒免疫组与对照组在IBV强毒攻毒后5 d时气管和肾脏内均可检测到病毒,各组病毒载量无显着差异,但攻毒后8 d重组病毒ILTV-ΔUS9-S株及ILTV-ΔUS9-S1株免疫组的咽拭子排毒率分别为50%,60%;攻毒后12 d分别为10%,0;相对于对照组在攻毒后8 d和12 d排毒率为80%和20%而言,两株重组病毒免疫后能够在一定程度上加速免疫鸡呼吸道内病毒的清除,但总体而言所激发的免疫保护作用较弱。综上所述,本研究成功构建了分别表达GI-19（QX）型IBV S蛋白和S1蛋白基因的重组ILTV,ILTV-ΔUS9-S株及ILTV-ΔUS9-S1株,两株重组病毒都能对ILTV强毒株攻击提供完全保护,也能够激发针对IBV GI-19（QX）型强毒株S1蛋白的免疫反应,但并不能提供针对IBV强毒的完全免疫保护作用,有待进一步改进和优化外源免疫原基因的表达水平,提升ILTV作为重组基因工程载体的潜在价值。
杜旭彬[3]（2021）在《TW Ⅰ型传染性支气管炎病毒“保护型”疫苗组合的筛选和弱毒疫苗的研制》文中研究说明传染性支气管炎（avian infectious bronchitis,IB）是由传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus,IBV）引起的急性、高度接触性传染病。IBV容易发生变异,血清型/基因型众多,不同型毒株之间存在较大的抗原差异。对于新出现的基因型,现有疫苗往往不能提供全面保护。在针对新基因型的疫苗问世之前,采用现有不同基因型疫苗的组合可以提供更好的交叉免疫保护,此为“保护型”疫苗组合的概念。TWⅠ型IBV毒株自2009年传入中国大陆,随后迅速蔓延,目前该型毒株已经占到我国流行毒株总数的15%。为了有效防控TWⅠ型毒株的流行,本研究拟筛选针对TWⅠ型IBV的“保护型”疫苗组合,并研制针对该型毒株的弱毒疫苗。1.TWⅠ型IBV“保护型”疫苗组合的筛选本研究首先平行比较了单独接种QXL87、LDT3-A、4/91和Ma5等现有商品化弱毒疫苗对TWⅠ型IBV毒株的免疫保护效果。将120只1日龄的商品雏鸡均分为5组,其中4组于1日龄通过滴鼻点眼方式接种上述4种弱毒疫苗,接种剂量为1羽份/只鸡,另1组为非免疫攻毒组。14日龄时,通过滴鼻点眼的方式接种TW Ⅰ型IBV AH1103强毒株,每只鸡106.0EID50/0.1 mL。攻毒后每日观察鸡的临床症状;攻毒后第5天,剖检观察大体病变和组织病理学病变;攻毒后第6天,进行气管纤毛活力评价;攻毒后第5天和第9天,检测呼吸道和泄殖腔排毒情况。结果表明,QXL87弱毒疫苗可提供针对TW Ⅰ型毒株的部分临床保护;而LDT3-A、4/91和Ma5弱毒疫苗对TWⅠ型毒株的保护效果均不理想,攻毒后出现严重的临床症状,且呼吸道和泄殖腔排毒较为严重。以QXL87弱毒苗为基础,分别与LDT3-A、4/91和Ma5组合使用,评价各种疫苗组合对TWⅠ型IBV毒株的保护效果。将120只1日龄的商品鸡均分为5组,分别为 QXL87+LDT3-A 组、QXL87+4/91 组、QXL87+Ma5 组、QXL87 组和攻毒对照组。QXL87+LDT3-A组、QXL87+4/91组、QXL87+Ma5组接种剂量为每种疫苗1羽份/只鸡,QXL87组的接种剂量为2羽份/只鸡,接种方式均为滴鼻点眼。免疫接种后第14天,所有试验鸡通过滴鼻点眼的方式接种TW Ⅰ型AH1103强毒株,剂量为106.0EID50/0.1 mL。攻毒后每日观察鸡的临床症状,定期剖检和对气管纤毛活力进行评价,并采集口腔拭子和泄殖腔拭子进行排毒监测。结果表明,QXL87弱毒疫苗与其它血清型疫苗联合使用可以减轻TWⅠ型毒株攻毒后临床症状,降低气管和泄殖腔的排毒量。综合考虑临床症状、大体病变、气管纤毛活力、排毒量和病理损伤等评价指标,QXL87+4/91组对TW Ⅰ型毒株的免疫保护效果优于其他组。因此,QXL87与4/91的组合为TW Ⅰ型IBV毒株的“保护型”疫苗组合。2.TW Ⅰ型IBV疫苗的研制与评价本研究将TW Ⅰ型IBV AH1103株在SPF鸡胚上连续传代至160代次,挑取第5代毒株建立攻毒模型,并对120代、140代、160代毒株进行安全性和免疫原性评价。通过观察各代次毒株接种7日龄SPF雏鸡后的临床症状、气管纤毛损伤程度、各器官载毒量以及组织病变情况,我们发现5代毒株可引起雏鸡呼吸道症状,气管充血、出血,肾脏肿大、肾脏尿酸盐沉积,而120代、140代、160代毒株均无明显的致病性。分别对120代、140代、160代毒株的免疫原性进行评价,发现免疫组的鸡在受到TWⅠ型毒株攻击时均未出现临床症状、气管纤毛受保护程度高,且呼吸道和泄殖腔的排毒量显着低于非免疫攻毒组。上述结果表明,AH1103毒株经在SPF鸡胚上传代,致病力充分降低的同时,仍然保留良好的免疫原性,可望成为TW Ⅰ型IBV弱毒疫苗候选毒株。
周琦[4]（2020）在《河北部分地区IBV分离株的基因序列分析及其间接ELISA方法的初步建立》文中研究说明鸡传染性支气管炎（IB）是由传染性支气管炎病毒（IBV）引起鸡的一种高度接触性、急性呼吸道传染病。该病传播速度快、发病率高,对养禽业的效益产生严重影响。IBV的基因组易发生变异和重组,导致其基因型和血清型众多,且交叉保护力弱,对养鸡业造成严重打击。不同地区或者同一地区的基因型都可能出现较大差别,及时了解本地流行毒株情况,对于该病的防控有重要意义。本研究通过对临床样本的检测,围绕IBV的同源性及变异分析,展开了相关研究,具体内容如下:1.河北部分地区IBV分离鉴定及序列分析:收集河北部分地区的疑似IB样本进行检测,对阳性样本进行测序分析,通过对14份阳性样本的S1基因与N基因的序列分析,发现有6株毒株与LX4株更为接近,约占到阳性样本的43%,同时分离到的14个毒株之间的S1基因相似性在69.799.8%。而同源性分析结果表明14个分离毒株的N基因之间的相似性为91.599.8%。2.IBV N蛋白的原核表达及纯化:通过设计特异性引物扩增了HB-ZD1909株S1基因和N基因,并成功构建了其重组质粒pGEX-6P-1-S1和pGEX-6P-1-N,通过IPTG诱导,获得了原核表达的S1蛋白和N蛋白。因S1蛋白纯化效果不理想,故选用可溶性表达且纯化效果好的的N蛋白作为后续实验的基础。3.间接ELISA检测方法的建立:通过原核表达并纯化的N蛋白,成功建立了IBV N蛋白的间接ELISA方法,经过一系列摸索和条件优化,该方法的最佳抗原包被条件为0.5μg/mL,最适合的包被条件为4℃包被过夜,阴阳性临界值确定为0.0996,最佳封闭液条件为5%脱脂乳封闭2 h,血清稀释倍数为1:100,最佳血清作用时间30 min,最佳二抗作用时间为60 min,底物作用时间为10min。重复性及特异性试验结果表明本试验获得的N蛋白可以替代IBV病毒来检测抗体,具有较好的应用价值,可作为快速诊断和免疫监测IBV的重要手段。
廖凯[5]（2020）在《TW Ⅰ型传染性支气管炎病毒的致病性评价与实时荧光定量PCR检测方法的建立》文中进行了进一步梳理传染性支气管炎（IB）是由传染性支气管炎病毒（IBV）引起的急性、高度接触性传染病,可导致鸡呼吸困难、肾脏尿酸盐沉积及死亡,给养鸡业造成了很大的经济损失。TW Ⅰ型IBV毒株于1996年中国台湾首次发现。自2009年传入大陆后,该型毒株在我国迅速蔓延。近几年,TW Ⅰ型IBV毒株分离率大约占我国IBV分离株总数的15%,成为了我国仅次于QX型的IBV第二大流行优势基因型。本研究系统地评价了 TW Ⅰ型毒株对雏鸡及产蛋鸡的致病性,建立了该型毒株的RT-qPCR检测方法,有利于遏制该型病毒在我国的进一步流行。1.TW Ⅰ型IBV毒株对鸡的致病性评价（1）早期感染TW Ⅰ型IBV毒株的致病性将1日龄SPF雏鸡随机分配到试验组和对照组,每组70只。通过滴鼻点眼方式,试验组雏鸡分别接种105.5 EID50/0.1 mL TW Ⅰ型IBV AH1103株,对照组雏鸡经相同方式接种等体积PBS。在200天的试验观察内,评价两组鸡的临床表现、生长发育、及产蛋情况;定期采集样品,进行病理组织学检查和带毒、排毒情况检查。感染初期,试验组雏鸡出现呼吸道症状,气管和肺脏充血、出血,肾脏尿酸盐沉积,以及输卵管膨大积液,死亡率约为10%。育成期期间,试验组输卵管膨大积液病理现象更加严重,生殖系统发育缓慢。产蛋观察期间,试验组总产蛋量相较对照组下降了 26%,所产鸡蛋的浓蛋白更稀薄,且输卵管组织细胞病理损伤明显,卵黄性腹膜炎的发病率为50%;试验组鸡的泄殖腔内重新检测到具有感染力的病毒,并证明了盲肠扁桃体是病毒持续存在鸡体内的部位。TW Ⅰ型IBV对雏鸡呼吸道、肾脏和输卵管具有致病性,影响鸡输卵管发育,降低产蛋数量及蛋品质,从而降低了蛋鸡饲养的经济价值。（2）产蛋期感染TW Ⅰ型IBV毒株的致病性将8只200日龄SPF产蛋母鸡随机分配到试验组和对照组,每组4只。通过滴鼻点眼方式,试验组各母鸡分别接种105.5 EID50/0.1 mL TW Ⅰ型IBV AH1103株,对照组经相同方式接种等体积PBS。连续观察8天,比较两组鸡的临床表现及蛋品质,检测病毒感染组织细胞部位,测定各组织病毒载量。试验组母鸡表现出明显的呼吸道症状,总产蛋量、蛋黄均重及蛋壳厚度较对照组分别下降了 14.5%,3.35%及10.8%,而蛋内肉斑率则增加了 87.5%。组织内病毒载量测定结果显示,病毒含量由多到少依次为卵泡、伞部、子宫部、及峡部。免疫组化结果显示,病毒感染了输卵管组织上皮细胞。TW Ⅰ型IBV对产蛋鸡呼吸道和输卵管损伤明显,可造成产蛋率和蛋品质下降,影响蛋鸡养殖的经济效益及鸡蛋营养价值。2.检测TW Ⅰ型IBV反转录-实时荧光定量PCR方法的建立通过序列比对,发现不同基因型IBV毒株的S1基因间存在部分显着差异的区域,据此分别设计了两套引物和探针,建立了检测TW Ⅰ型IBV毒株的RT-qPCR方法。两套引物和探针组合建立的qPCR方法特异性良好,与包括QX、MASS、TC07-2、793B和LDT3-A型在内的其它基因型IBV毒株无交叉反应;敏感性良好,对101～109拷贝/μL浓度范围的底物均具有准确检测能力;重复性良好,其CT值组内变异系数均低于2%,组间变异系数均低于5%。两套引物和探针组合中的任意一套检测阳性均可做出阳性结果判断,且两套引物和探针组合的检测结果可以相互印证,该方法可用于对IB疑似病例中TW Ⅰ型IBV毒株的定向筛查。
陈彤[6]（2019）在《2016-2018年IBV分子流行病学及TW型IBV弱毒疫苗的研究》文中提出传染性支气管炎（IB）是由传染性支气管炎病毒（IBV）引起的一种急性、高度接触性传染的禽类疾病,严重影响着世界养禽业的发展。IBV基因组具有非常高的突变率和重组率,在有宿主选择压和疫苗免疫压时更易发生突变,该特征导致IBV拥有众多血清型和基因型,由于IBV不同血清型与基因型之间交叉保护力较差,使得IB成为当前禽类疾病中最难防控的疾病之一。近几年,TW型IBV在中国南方流行逐年增多,成为普遍流行的基因型,目前尚无对型疫苗进行防控。为了解决上述问题,本研究开展了以下相关实验:本研究从国内13个省、自治区、直辖市的肉鸡IB发病病料中分离鉴定出133株IBV毒株。对分离株进行S1基因遗传进化分析发现,其中122株分离株可分为8个基因型,QX型为优势基因型,此型毒株占分离毒株的62.4%,TW型毒株占分离毒株的9.8%。4/91型毒株分离也较多,占总分离毒株的9.8%,其中4株毒株与疫苗株同源性超过99.7%,是否为疫苗株还需进一步验证。此型毒株广泛参与病毒重组。另外,还分离到11株变异株,占总分离株的9%,分别形成独立的进化分支,进一步分析发现变异株均为重组毒株,主要为4/91型、QX型和TW型毒株间相互重组,其中4/91型毒株参与重组的毒株占总变异株的63.6%。本研究选取国内不同IBV弱毒疫苗评价对QX型IBV和TW型IBV的免疫保护效果,结果发现同一疫苗两次免疫效果低于不同疫苗联合免疫效果,如两次单独免疫疫苗CAB和疫苗AMI可对QX型IBV攻毒组分别提供86.6%和73.3%的保护,但当采用CAB+AMI免疫组合后可提供93.3%的保护。然而,所有疫苗组合均不能有效保护TW型IBV攻毒组,保护率均低于50%。鉴于TW型IBV已成为国内第二大流行基因型病毒,因此有必要开展TW型IBV弱毒疫苗的研究。本研究通过对TW型IBV GX15毒株进行SPF胚连续传代培养,获得了1株TW型致弱株GX15F105。安全性实验表明,随着GX15病毒在SPF胚中持续传代,该毒株对鸡胚的适应力逐渐增强,而对雏鸡致病力逐渐下降,特别是F80以后代次接种10日龄SPF雏鸡不再发生死亡;组织病理学观察证实F95病毒对气管、肺脏和肾脏的致病力明显减弱,当传至F105时接种鸡各组织微观结构与空白对照组鸡只相同。进一步攻毒实验证实接种GX15F105可以抵抗GX15F5的攻击,相对保护率可达80%;气管纤毛停滞实验证实F105(103.5EID50)组、F105(104.5EID50)组和F95(103.5EID50)组气管纤毛运动能力正常,与空白对照组无异着差异,提示GX15F105具有较好的免疫原性;主要器官病毒载量测定实验进一步证实,F95和F105组在攻毒后各器官病毒拷贝数极其显着低于攻毒对照组（P<0.001）,且F105组更优于F95组;不同代次毒株全基因测序分析发现F50、F80、F95和F105多个位点核苷酸发生稳定的点突变、核苷酸插入和缺失,并最终导致GXF105全基因组中19个氨基酸发生稳定的插入与替换,这些突变可能是导致GXF105致病力减弱的原因。综上所述,本研究对我国南方IBV流行情况进行流行病学监控,掌握了其主要流行趋势,筛选出针对QX型IBV毒株的最佳疫苗组合,并制备了1株TW型IBV弱毒株GX15F105,实验证实该弱毒株具有良好的安全性和免疫原性,可作为防控TW型IBV潜在的疫苗候选株。
黄梦姣,张芸,薛春宜,曹永长[7]（2019）在《应对日益严峻的挑战:中国禽传染性支气管炎研究》文中认为自1937年禽传染性支气管炎病毒在美国被首次分离以来,该病毒的传播给世界养禽业带来了严重的经济损失。中国地域辽阔、气候多样,国内该病毒的流行情况十分复杂。本文就传染性支气管炎在国内的病原分离、分子流行病学、检测技术、疫苗及综合防控技术等方面的研究与实践进行总结。目前,该病毒在中国多种类型毒株并存,优势流行毒株为QX基因型毒株。除广泛使用的H120等Mass血清型疫苗外,4/91血清型疫苗和LDT3-A株疫苗也被逐步使用,多采用弱毒疫苗和灭活疫苗联合免疫的方法有效控制了其对养禽业造成的经济损失。
张琳婧[8]（2019）在《两株鸡传染性支气管炎病毒的分离、全基因组测序及其S1基因的克隆表达》文中指出鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus,IBV）感染引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。由于IBV基因组易发生变异和重组,IBV的基因型和血清型复杂多样,且不同血清型间交叉保护性效果不理想。新基因型甚至新血清型不断出现,给IBV的有效防控带来了巨大困难。本研究从疑似IBV感染的IBV免疫鸡群分离鉴定出2株IBV,并对其全基因组进了测序分析以及克隆表达了S1基因。为进一步了解丰富国内IBV流行株的重组变异情况,潜在的免疫逃逸机制以及疫苗毒株筛选依据等积累了数据。1、两株鸡传染性支气管炎病毒的分离与鉴定本研究首先从疑似IBV感染的IBV免疫鸡群采集发病鸡脏器进行鸡胚接种病毒分离。5天后发现接种两个肾脏样品的鸡胚出现典型的卷曲侏儒胚。但其尿囊液不具有血凝现象,以尿囊液提取的RNA反转录的cDNA为模版。用IBV的S基因特异性引物进行了 PCR扩增鉴定,PCR扩增以及序列测序表明能从两个尿囊液样品中扩增出IBV的S基因特异性片段,同时将分离到的这两个毒株分别命名为IBV34以及IBV216。应用DNAStar分析软件的Clustal W将克隆到的IBV34以及IBV216毒株S1基因分别与Gen Bank中国内外IBV参考毒株的S1基因进行序列比较和同源性分析发现IBV34以及IBV216毒株均属于QX型IBV。IBV34以及IBV 216毒株的S1基因与QX型的LX4毒株同源性分别高达95.5%以及95.4%。值得注意的是,与IBV34毒株以及Gen Bank中其它国内外IBV的S1基因不同,IBV 216毒株的S1基因缺了 12个碱基。从IBV免疫鸡群分离鉴定出的IBV34以及IBV 216毒株对进一步探究IBV免疫逃逸机制提供了材料。2、两株鸡传染性支气管炎病毒的全基因组测序与分析为进一步分析从从IBV免疫鸡群分离鉴定出的IBV34以及IBV 216毒株可能存在的变异以及重组现象。本研究利用21对引物,通过PCR扩增,TA克隆以及序列测序对分离株IBV34及IBV216的全基因组进行了解析。结果发现分离株IBV34以及IBV216全基因组全长分别为27647bp与27654bp（不包括5’端帽子和3’端polyA尾巴）。基因组结构符合IBV的基因组基本特征。IBV34以及IBV 216毒株的全基因组序列与QX型的YXI0毒株的全基因组序列同源性分别高达96.6%以及96.7%。重组事件分析进一步发现,IBV34毒株基因组中鉴定出2个重组事件。分别位于IBV 34基因组5567-8121片段、8672-11925片段。IBV216毒株基因组中同样鉴定出2个重组事件。分别位于5564-7886片段、8402-11923片段。重组来源分析显示IBV34和IBV216来源于QX型与TC07-2型基因型IBV重组。3、两株鸡传染性支气管炎病毒S1基因的克隆为进一步探究这两株来自IBV免疫鸡群的IBV毒株的S1蛋白的抗原性。本研究将IBV34以及IBV 216毒株的S1基因分别克隆至线性化载体pGEX-6p-I和pcDNA3.1上。成功构建了 S1原核表达载体pGEX-6P-1-IBV34-S1、pGEX-6P-1-IBV216-S1及真核表达载体 pcDNA3.1-IBV34-S1、pcDNA3.1-IBV216-SI。将重组子 pGEX-6P-1-IBV34-S1、pGEX-6P-I-IBV216-S1分别转化至BL-21感受态中。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析发现GST-S1蛋白不仅可以以包涵体形式表达,而且还可以以可溶性形式表达。利用抗QX型IBV血清对真核表达载体pcDNA3.1-IBV34-S1以及pcDNA3.1-IBV216-S1的表达进行了验证。结果发现,所用的抗QX型IBV血清能很好的识别转染pcDNA3.1-IBV34-S1的LMH细胞。可见亮绿色荧光;而在转染pcDNA3.1-IBV216-S1的LMH细胞以及转染对照载体pcDNA3.1的DF-1细胞中未见亮绿色特异性荧光。这一结果提示IBV216毒株S1蛋白中缺失的4个氨基酸（62-65aa）可能影响S1蛋白的抗原性以及血清的免疫反应性。
潘力[9]（2019）在《传染性支气管炎病毒SD/04/18株感染鸡体内各组织中病毒的动态分布及排毒规律研究》文中提出禽传染性支气管炎（Avian Infectious Bronchitis,AIB）是由传染性支气管炎病毒（IBV）引起的一种高度接触性传染病。IBV可引起鸡呼吸道、肾脏和生殖道等部位病变,并造成死亡,给养鸡业造成巨大经济损失。IBV不同血清型之间交叉保护性低,新IBV血清型的不断出现给本病的防控带来困难。目前,国内外还没有制定统一的IBV分型标准,但众多学者多采用IBV的S1基因序列分型法。由于不同基因型的IBV在组织嗜性和致病性方面有着较大的差异,因此需要对新分离株进行系统研究,为该病的防控提供依据。本试验从山东某地疑似患鸡传染性支气管炎（IB）的送检病死鸡中分离到一株病毒,经RT-PCR鉴定及测序分析,确定为IBV并命名为SD/04/18株。根据测序结果,对其S1基因进行遗传分析,发现该毒株与我国主要流行的QX基因型IBV同源性最高。经胰蛋白酶消化液处理的SD/04/18株测得了血凝效价;将SD/04/18株接种8日龄SPF鸡,复制出了与自然感染病例相同的临床症状。为系统性研究IBV SD/04/18株,首先,根据GenBank中已发表的IBV的N基因序列设计引物,建立IBV Real-TimePCR检测方法,该方法最低能检测到39.7 copies/μL的病毒核酸;其次,将经典呼吸型IBV-M41标准株与分离的SD/04/18株先通过SPF鸡胚连续传代,再经鸡胚肾原代细胞（CEK）和非洲绿猴肾细胞（Vero）盲传至引起细胞明显病变,同时定量检测每一代次病毒。结果显示,IBV-M41株在CEK原代细胞和Vero细胞上分别传至第4代、第5代时出现明显病变;而SD/04/18株在上述两种细胞上分别传至第5代、第6代时出现明显病变;经连续传代,最终获得能稳定增殖的IBV-M41标准株和SD/04/18分离株。为探讨SD/04/18株在不同感染阶段对宿主相关器官的病理损伤、组织嗜性、动态分布、排毒规律及宿主抗体水平的影响,进行了下列试验。首先建立IBV SD/04/18株雏鸡感染模型,并在感染后的3 d、7 d、30 d采集气管、肺、肾、脾、胸腺、法氏囊制作病理切片及免疫组化分析;其次,在感染后不同时间点采集12种组织器官进行病毒动态分布检测,同时定期检测感染鸡只的呼吸道和泄殖腔的排毒情况、统计体重及抗体水平。结果显示,不同感染阶段的相同器官病理变化存在差异,感染发病30 d时,气管、肺、脾、胸腺得到了很好的恢复,但肾脏和法氏囊病变依然严重;免疫组化法检测到上述器官均有可见抗原聚集;感染后6 h,在气管、喉头、肺等部位首先检测到相应载量的病毒,整个过程中,脑、胰脏病毒载量较为稳定,其余各器官的病毒载量整体呈现先增多后减少的趋势;人工感染第1 d和第3 d分别在呼吸道和泄殖腔检测到病毒核酸,30 d时仍能从上述两个部位检出病毒核酸;5 d时在被感染鸡群中检测到IBV抗体阳性,抗体滴度峰值出现在感染后27 d;感染发病鸡临床症状明显,两组试验鸡体重差异显着。总之,通过对分离到的QX基因型IBV SD/04/18株的系统性研究,确定了SD/04/18株在临床分型上属肾型IBV。该毒株主要引起发病鸡肾脏病变,对宿主的免疫器官也具有不同程度的损伤,发病鸡排毒时间长,增重慢;靶器官带毒时间长、病毒载量高,各器官病毒载量与宿主抗体水平整体呈现负相关。经过鸡胚、细胞盲传后,SD/04/18株能在体外稳定增殖。以上实验结果,将为抗IBV药物的研究提供理想的动物模型并为后续IBV的相关机制研究提供理论依据和实验素材。
汪宏才,温国元,罗青平[10]（2018）在《新城疫多联疫苗研究进展》文中研究指明新城疫（Newcastle disease,ND）的防控主要通过生物安全和加强免疫进行预防。目前预防新城疫的疫苗主要有弱毒疫苗和灭活疫苗。为了降低成本、减少免疫次数,达到"一针防多病"的目的,国内外很多学者在新城疫单苗的基础上研制出了一系列多联疫苗。通过对中国新城疫多联疫苗的研究进展进行阐述,分析了疫苗的应用效果,为临床应用提供参考。
二、鸡传染性支气管炎肾型弱毒株J_9的安全性试验（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鸡传染性支气管炎肾型弱毒株J_9的安全性试验（论文提纲范文）
（1）GVI-1型传染性支气管炎病毒的RT-qPCR检测方法建立、致病性评价和弱毒疫苗株培育（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 文献综述 |
| 1 IBV的基因组结构和编码蛋白的主要生物学功能 |
| 2 GVI-1型IBV的流行 |
| 3 IBV的致病性 |
| 4 IBV的检测 |
| 4.1 病毒的分离培养 |
| 4.2 血清学 |
| 4.3 分子生物学 |
| 5 IB的防控 |
| 第2章 检测IBV GVI-1基因型毒株的RT-qPCR方法建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 试剂和仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物探针的设计与合成 |
| 2.2 质粒标准品的制备 |
| 2.3 标准曲线的建立 |
| 2.4 敏感性试验 |
| 2.5 特异性试验 |
| 2.6 重复性试验 |
| 2.7 样品检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 引物和探针的设计 |
| 3.2 质粒标准品的制备 |
| 3.3 荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 3.4 敏感性试验 |
| 3.5 特异性试验 |
| 3.6 重复性试验 |
| 3.7 样品检测 |
| 4 讨论 |
| 第3章 GVI-1基因型IBV毒株的致病性评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 SPF鸡和SPF鸡胚 |
| 1.3 主要试剂和仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 JX181毒株对雏鸡的致病力 |
| 2.2 JX181毒株对产蛋鸡的致病力 |
| 3 结果 |
| 3.1 JX181毒株对雏鸡的致病力 |
| 3.2 JX181毒株对产蛋鸡的致病力 |
| 4 讨论 |
| 第4章 GVI-1基因型IBV弱毒株的培育及其安全性和免疫效力的初步评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 SPF鸡和SPF鸡胚 |
| 1.3 主要试剂和仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 毒株致弱 |
| 2.2 毒株的纯净性检验 |
| 2.3 不同代次毒株的安全性评价 |
| 2.4 不同代次毒株的免疫保护性评价 |
| 3 结果 |
| 3.1 毒株致弱 |
| 3.2 毒株的纯净性检验 |
| 3.3 不同代次毒株的安全性评价 |
| 3.4 不同代次毒株的免疫保护性评价 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（2）表达IBV纤突蛋白的ILT重组病毒构建及其免疫效果评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 鸡传染性支气管炎概述 |
| 1.1.1 鸡传染性支气管炎流行病学特征 |
| 1.1.2 鸡传染性支气管炎病毒生物学特性 |
| 1.1.3 鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白概述 |
| 1.1.4 鸡传染性支气管炎疫苗研究进展 |
| 1.2 鸡传染性喉气管炎病毒及其作为疫苗载体的应用 |
| 1.2.1 疱疹病毒作为疫苗载体的优点 |
| 1.2.2 鸡传染性喉气管炎流行病学 |
| 1.2.3 疱疹病毒的US9 基因 |
| 1.2.4 鸡传染性喉气管炎病毒疫苗研究进展 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 第二章 表达IBV纤突蛋白的ILT重组病毒的构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、病毒与鸡胚 |
| 2.1.2 质粒与菌株 |
| 2.1.3 酶及主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器和设备 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 转移质粒的构建 |
| 2.2.2 重组病毒的构建及鉴定 |
| 2.2.3 重组病毒的生长特性研究 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 转移质粒p ILTΔUS9-S、p ILTΔUS9-S1 的构建 |
| 2.3.2 重组病毒ILTV-ΔUS9-S株、ILTV-ΔUS9-S1 株的构建及鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 IBV S1 蛋白单克隆抗体的制备 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、病毒及实验动物 |
| 3.1.2 质粒与菌株 |
| 3.1.3 酶及主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器和设备 |
| 3.1.5 引物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 重组蛋白的构建 |
| 3.2.2 杂交瘤细胞的筛选 |
| 3.2.3 单克隆抗体的制备及效价检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 IBV CK/CH/LDL/091022 毒株S1 蛋白的真核表达 |
| 3.3.2 杂交瘤细胞的制备及单克隆抗体鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 表达IBV纤突蛋白的ILT重组病毒的免疫效果评价 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞、病毒、鸡与鸡胚 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器和设备 |
| 4.1.4 引物 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 重组病毒对ILTV WG株的免疫保护评价 |
| 4.2.2 重组病毒对IBV CK/CH/LDL/091022 分离株的免疫保护评价 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 重组病毒ILTV-ΔUS9-S株、ILTV-ΔUS9-S1 株对ILTV的免疫保护作用评价 |
| 4.3.2 重组病毒ILTV-ΔUS9-S株、ILTV-ΔUS9-S1 株对IBV的免疫保护作用评价 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）TW Ⅰ型传染性支气管炎病毒“保护型”疫苗组合的筛选和弱毒疫苗的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 IBV的致病性 |
| 2 IBV的流行状况 |
| 3 IBV的“保护型”概念 |
| 4 IBV弱毒疫苗 |
| 5 研究目的和意义 |
| 第二章 TW Ⅰ型传染性支气管炎病毒“保护型”疫苗组合的筛选 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 TW Ⅰ型传染性支气管炎弱毒疫苗的研制与评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（4）河北部分地区IBV分离株的基因序列分析及其间接ELISA方法的初步建立（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 IBV概述 |
| 1.1.1 IBV病原学简介 |
| 1.1.2 IBV结构蛋白及其生物学特性 |
| 1.1.3 IBV分型 |
| 1.2 IBV流行病学 |
| 1.2.1 IBV的流行与传播 |
| 1.2.2 IBV主要临床分型 |
| 1.2.3 IBV的防控 |
| 1.3 IBV疫苗研究进展 |
| 1.3.1 IBV灭活疫苗 |
| 1.3.2 IBV弱毒疫苗 |
| 1.3.3 IBV基因工程苗 |
| 1.3.4 活病毒载体疫苗 |
| 1.4 IBV检测方法研究进展 |
| 1.4.1 RT-PCR检测 |
| 1.4.2 ELISA检测 |
| 1.4.3 胶体金试纸条 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 第二章 河北部分地区IBV分离鉴定与基因序列分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂、材料 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 其它生物材料和试剂 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 病料来源 |
| 2.2.2 引物设计 |
| 2.2.3 病毒总RNA提取及逆转录 |
| 2.2.4 基因扩增 |
| 2.2.5 鸡胚接毒 |
| 2.2.6 RT-PCR产物的纯化回收 |
| 2.2.7 纯化回收产物的连接 |
| 2.2.8 感受态细胞的制备 |
| 2.2.9 重组质粒的转化、鉴定及序列测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 临床样本PCR鉴定 |
| 2.3.2 鸡胚病变 |
| 2.3.3 扩增结果 |
| 2.3.4 T载体构建 |
| 2.3.5 构建进化树 |
| 2.3.6 同源性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白和N蛋白的原核表达 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 病毒、载体及基因工程菌 |
| 3.1.2 主要生化试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 引物设计与合成 |
| 3.2.2 原核蛋白的克隆与鉴定 |
| 3.2.3 原核表达载体的构建 |
| 3.2.4 重组质粒的表达及纯化 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 基因片段的克隆与鉴定 |
| 3.3.2 原核表达载体的构建 |
| 3.3.3 重组质粒的表达及鉴定 |
| 3.3.4 原核蛋白的纯化 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 IBV N蛋白间接ELISA检测方法的建立 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂、材料 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 试剂的配制 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定 |
| 4.2.2 阴阳临界值的确定 |
| 4.2.3 确定抗原最佳包被条件 |
| 4.2.4 最佳封闭液的选择 |
| 4.2.5 确定最佳封闭时间 |
| 4.2.6 确定血清孵育时间 |
| 4.2.7 确定二抗孵育时间 |
| 4.2.8 确定底物作用时间 |
| 4.2.9 特异性试验 |
| 4.2.10 重复性试验 |
| 4.2.11 敏感性试验 |
| 4.2.12 临床样本检验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定 |
| 4.3.2 阴阳临界值的确定 |
| 4.3.3 确定抗原最佳包被条件 |
| 4.3.4 最佳封闭液的选择 |
| 4.3.5 确定最佳封闭时间 |
| 4.3.6 确定血清孵育时间 |
| 4.3.7 确定二抗孵育时间 |
| 4.3.8 确定底物作用时间 |
| 4.3.9 特异性试验 |
| 4.3.10 重复性试验 |
| 4.3.11 敏感性试验 |
| 4.3.12 临床样本检验 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 N蛋白的选择 |
| 4.4.2 间接ELISA检测方法各项条件的优化 |
| 4.4.3 间接ELISA检测方法的特性 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（5）TW Ⅰ型传染性支气管炎病毒的致病性评价与实时荧光定量PCR检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 传染性支气管炎病毒及国内疫情控制 |
| 1 传染性支气管炎病毒 |
| 1.1 病原 |
| 1.2 病毒分型 |
| 1.3 国内流行基因型 |
| 1.4 致病性 |
| 2 我国IB疫情的控制 |
| 2.1 免疫接种 |
| 2.2 面临的问题 |
| 3 IBV的检测 |
| 3.1 病毒的分离与鉴定 |
| 3.2 血清学检测 |
| 3.3 分子生物学检测 |
| 第二章 TW Ⅰ型IBV致病性评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 鸡早期感染TWI型IBV毒株 |
| 2.2 鸡产蛋期感染TWI型IBV毒株 |
| 3 结果 |
| 3.1 早期感染TWI型毒株 |
| 3.2 产蛋期感染TWI毒株 |
| 4 讨论 |
| 第三章 特异性检测TW Ⅰ型IBV RT-qPCR方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物和探针设计 |
| 2.2 建立标准曲线 |
| 2.3 特异性检测 |
| 2.4 敏感性检测 |
| 2.5 重复性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 标准曲线 |
| 3.2 特异性 |
| 3.3 敏感性 |
| 3.4 重复性 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（6）2016-2018年IBV分子流行病学及TW型IBV弱毒疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 IB的概述 |
| 1.2 IB病原学 |
| 1.3 IBV宿主 |
| 1.4 病毒进化与基因型的多样性 |
| 1.5 致病机理和临床特征 |
| 1.6 IBV流行情况 |
| 1.6.1 北美洲 |
| 1.6.2 拉丁美洲 |
| 1.6.3 非洲 |
| 1.6.4 中东区域 |
| 1.6.5 欧洲 |
| 1.6.6 亚洲 |
| 1.7 IBV疫苗研究进展 |
| 1.7.1 IBV活疫苗研究进展 |
| 1.7.2 重组IBV疫苗 |
| 1.7.3 亚单位疫苗和多肽苗 |
| 1.7.4 IBV反向遗传重组疫苗 |
| 1.8 本研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品、分离毒株 |
| 2.1.2 实验鸡胚、鸡 |
| 2.1.3 毒株与疫苗 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病料采集与毒株的分离培养 |
| 2.2.2 毒株的鉴定 |
| 2.2.2.1 血液凝集试验 |
| 2.2.2.2 鸡胚发育受阻试验 |
| 2.2.2.3 NDV干扰试验 |
| 2.2.2.4 RT-PCR鉴定 |
| 2.2.3 IBV分子流行病学研究 |
| 2.2.3.1 引物的合成 |
| 2.2.3.2 病毒RNA的提取 |
| 2.2.3.3 S1 基因的RT-PCR扩增 |
| 2.2.3.4 RT-PCR产物的回收与纯化 |
| 2.2.3.5 PCR纯化产物与载体连接 |
| 2.2.3.6 连接产物转化感受态细胞 |
| 2.2.3.7 重组质粒的筛选和鉴定 |
| 2.2.3.8 IBVS1基因序列测定及序列比较分析 |
| 2.2.3.9 S1基因重组分析 |
| 2.2.4 不同毒株间血清交叉中和特性分析 |
| 2.2.4.1 不同基因型IBV灭活油乳剂的制备 |
| 2.2.4.2 单因子阳性血清的制备 |
| 2.2.4.3 血清交叉中和试验 |
| 2.2.5 QX型 IBV与 MS-LY共感染攻毒模型的建立 |
| 2.2.6 IBV弱毒疫苗免疫谱的研究 |
| 2.2.6.1 对QX型IBV野毒株的保护效果评估 |
| 2.2.6.2 对TW型IBV野毒株的保护效果评估 |
| 2.2.7 TW型 IBV毒株GX15 的致弱与评估 |
| 2.2.7.1 TW型 IBV毒株GX15 的种毒纯化 |
| 2.2.7.2 GX15种毒的致病性研究 |
| 2.2.7.3 GX15毒株的传代致弱 |
| 2.2.7.4 GX15不同代次致弱效果评估 |
| 2.2.8 GX15毒株F95、F105攻毒保护评价 |
| 2.2.8.1 GX15F5种毒LD_(50)的测定 |
| 2.2.8.2 GX15毒株F95、F105有效性评估实验 |
| 2.2.9 GX15不同代次病毒全基因测序分析 |
| 2.2.9.1 全基因序列引物的设计与合成 |
| 2.2.9.2 TW型 IBV GX15 全基因序列测定 |
| 2.2.9.3 IBVGX15全基因序列比对及分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 IBV毒株的分离鉴定结果统计 |
| 3.2 IBV分离株S1基因的测序与分析 |
| 3.2.1 IBV分离株S1基因的鉴定 |
| 3.2.2 分离株S1基因遗传进化分析 |
| 3.2.2.1 分离株S1基因序列分析 |
| 3.2.2.2 分离株S1基因系统发育分析 |
| 3.2.2.3 分离株S1基因同源性分析 |
| 3.2.2.4 S1基因重组分析 |
| 3.3 不同毒株间血清交叉中和特性分析 |
| 3.3.1 IBV不同毒株单因子阳性血清制备 |
| 3.3.2 IBV不同毒株间血清交叉中和特性分析 |
| 3.4 不同IBV弱毒疫苗免疫谱分析 |
| 3.4.1 QX型 IBV与 MS-LY共感染攻毒模型的建立 |
| 3.4.2 IBV不同弱毒疫苗组合免疫效果 |
| 3.4.2.1 不同弱毒疫苗组合对QX型IBV攻毒保护效果 |
| 3.4.2.2 IBV不同弱毒疫苗组合对QX型 IBV排毒率检测 |
| 3.4.2.3 弱毒疫苗组合对TW型IBV保护效果 |
| 3.4.2.4 TW型IBV攻毒后排毒规律 |
| 3.4.2.5 攻毒组抗体变化规律 |
| 3.5 TW型 IBV GX15 毒株的致弱与评估 |
| 3.5.1 TW型GX15毒株的纯化与传代 |
| 3.5.2 TW型GX15种毒的致病性研究 |
| 3.5.3 TW型 IBV GX15 不同代次致弱效果评估 |
| 3.5.3.1 GX15不同代次致病力变化规律研究 |
| 3.5.3.2 病理切片结果 |
| 3.5.4 GX15 F95和GX15F105 免疫有效性评估 |
| 3.5.4.1 GX15F5攻毒组LD_(50)的测定结果 |
| 3.5.4.2 GX15F95和F105攻毒保护结果 |
| 3.5.4.3 气管纤毛停滞实验结果 |
| 3.5.4.4 病毒排毒率检测结果 |
| 3.5.4.5 主要器官病毒载量的检测结果 |
| 3.5.5 GX15不同代次病毒全基因测序分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 IBV分子流行病学研究 |
| 4.2 不同IBV弱毒疫苗免疫谱研究 |
| 4.3 TW型 IBV GX15 弱毒疫苗的制备与评估 |
| 5 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 :攻读硕士学位期间发表的论文 |
（7）应对日益严峻的挑战:中国禽传染性支气管炎研究（论文提纲范文）
| 1 禽传染性支气管炎病毒 |
| 2 中国IBV毒株分离与鉴定 |
| 3 IBV分子流行病学研究 |
| 4 IBV检测技术研究 |
| 5 IBV疫苗开发 |
| 6 IBV免疫程序研究 |
| 7 IBV综合防控措施 |
| 8 结语 |
（8）两株鸡传染性支气管炎病毒的分离、全基因组测序及其S1基因的克隆表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 第一节 鸡传染性支气管炎病毒研究进展 |
| 1.1 鸡传染性支气管炎病毒概况 |
| 1.2 IBV病毒的形态结构与理化特性 |
| 1.3 IBV的流行病学 |
| 1.4 IBV的致病性 |
| 1.5 IBV主要蛋白及其功能 |
| 1.5.1 S蛋白 |
| 1.5.2 M蛋白 |
| 1.5.3 N蛋白 |
| 1.5.4 E蛋白 |
| 1.5.5 非结构蛋白 |
| 1.6 IBV的变异与重组 |
| 1.7 IBV分型 |
| 1.8 IBV的免疫防控 |
| 1.8.1 弱毒疫苗 |
| 1.8.2 灭活疫苗 |
| 1.8.3 核酸疫苗 |
| 第二节 研究目的及意义 |
| 研究内容一 两株鸡传染性支气管炎病毒的分离与鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要试剂的配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒的繁殖 |
| 2.2 引物的设计 |
| 2.3 病毒RNA的提取 |
| 2.4 cDNA的制备 |
| 2.5 目的片段的扩增 |
| 2.6 PCR纯化产物的连接和转化 |
| 2.7 连接反应产物转化涂板 |
| 2.8 菌落PCR鉴定 |
| 3. 结果 |
| 3.1 病毒鸡胚接种结果 |
| 3.2 两株IBV病毒与20株IBV参考毒株S1基因序列比较 |
| 4 讨论 |
| 研究内容二 两株鸡传染性支气管炎病毒的全基因组测序与分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试验材料 |
| 1.2 主要材料 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒的增殖 |
| 2.2 引物的设计 |
| 2.3 病毒RNA的提取 |
| 2.4 cDNA的制备 |
| 2.5 目的片段的扩增 |
| 2.6 PCR纯化产物的连接和转化 |
| 2.7 连接反应产物转化涂板 |
| 2.8 全基因组测序分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 IBV34与IBV216两株病毒各个基因片段扩增结果 |
| 3.2 IBV34和IBV216毒株全基因组结构 |
| 3.3 分离株IBV 34基因组的同源重组分析 |
| 3.4 分离株IBV216基因组的同源重组分析 |
| 4 讨论 |
| 研究内容三 两株鸡传染性支气管炎病毒S1基因的克隆表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2. 方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 RNA的提取 |
| 2.3 cDNA的制备 |
| 2.4 目的片段的扩增 |
| 2.5 RT-PCR产物的胶回收 |
| 2.6 重组质粒的构建 |
| 2.7 重组质粒的鉴定 |
| 2.8 重组蛋白的诱导表达及鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 两株IBV病毒S1基因片段的扩增及重组子构建 |
| 3.2 重组蛋白GST-S1表达的SDS-PAGE鉴定 |
| 3.3 重组蛋白GST-S1表达的Western-blot鉴定 |
| 3.4 间接免疫荧光鉴定S1蛋白真核表达 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）传染性支气管炎病毒SD/04/18株感染鸡体内各组织中病毒的动态分布及排毒规律研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1.引言 |
| 1.1 鸡传染性支气管炎 |
| 1.2 鸡传染性支气管炎病毒病原学研究进展 |
| 1.2.1 IBV的病原学简介 |
| 1.2.2 IBV的结构蛋白及功能 |
| 1.2.3 IBV的非结构蛋白及功能 |
| 1.3 IBV的基因型和血清型研究进展 |
| 1.3.1 国外的IBV基因型和血清型研究进展 |
| 1.3.2 国内的IBV基因型和血清型研究进展 |
| 1.4 IBV的分子遗传变异机制研究进展 |
| 1.5 IBV诱导的天然免疫应答研究进展 |
| 1.6 鸡传染性支气管炎病毒体外培养研究概况 |
| 1.7 鸡传染性支气管炎的诊断技术简介 |
| 1.8 鸡传染性支气管炎的防控措施简介 |
| 1.9 研究目的与意义 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 2.4 常用试剂的配制 |
| 2.4.1 抗生素的配制 |
| 2.4.2 不同浓度氯化钠溶液的配制 |
| 2.4.3 胰蛋白酶-EDTA溶液的配制 |
| 2.4.4 不同浓度胰蛋白酶溶液的配制 |
| 2.4.5 PBS的配制 |
| 2.4.6 LB液体培养基的配制 |
| 2.4.7 LB固体培养基的配制 |
| 2.4.8 氨苄西林固体培养基的配制 |
| 2.4.9 细胞培养基的配制 |
| 2.4.10 1×TE电泳液的配制 |
| 2.4.11 琼脂糖凝胶的制作 |
| 2.4.12 1%红血球的制备 |
| 2.4.13 4%甲醛组织固定液的配制 |
| 2.5 试验方法 |
| 2.5.1 引物设计 |
| 2.5.2 病料的处理 |
| 2.5.3 病毒核酸的提取 |
| 2.5.4 目的基因的RT-PCR扩增 |
| 2.5.5 RT-PCR产物的纯化回收 |
| 2.5.6 目的基因的连接、转化 |
| 2.5.7 重组质粒的提取、鉴定与测序分析 |
| 2.5.8 SD/04/18 株的S1 基因遗传进化分析 |
| 2.5.9 重组质粒的浓度测定与稀释 |
| 2.5.10 标准质粒Real-TimePCR扩增 |
| 2.5.11 IBV实时定量PCR检测标准曲线的建立 |
| 2.5.12 SD/04/18 株的EID50 测定 |
| 2.5.13 SD/04/18 株的血凝效价测定 |
| 2.5.14 细胞复苏 |
| 2.5.15 细胞传代 |
| 2.5.16 鸡胚肾原代细胞的制备 |
| 2.5.17 动物回归试验 |
| 2.5.18 SD/04/18 株体外增殖与细胞病变情况 |
| 2.5.19 病毒定量检测 |
| 2.5.20 SD/04/18 株多克隆抗体的制备与特异性验证 |
| 2.5.21 人工感染发病 |
| 2.5.22 病料采集与处理 |
| 2.5.23 病理组织切片制作 |
| 2.5.24 免疫组织化学法分析 |
| 2.5.25 病毒动态分布检测 |
| 2.5.26 排毒检测 |
| 2.5.27 人工感染SD/04/18 株的抗体水平检测 |
| 2.5.28 数据处理与分析 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 病毒分离鉴定结果 |
| 3.2 SD/04/18 株的S1 基因测序分析结果 |
| 3.3 重组质粒PCR鉴定结果 |
| 3.4 IBV实时定量PCR检测标准曲线的建立 |
| 3.4.1 标准曲线的灵敏度 |
| 3.4.2 扩增曲线的重复性 |
| 3.4.3 标准曲线的特异性 |
| 3.4.4 标准曲线相关参数 |
| 3.5 SD/04/18 株的EID50 测定与胚胎发育情况 |
| 3.6 SD/04/18 株的血凝效价测定 |
| 3.7 动物回归试验与临床症状 |
| 3.8 SD/04/18 株致细胞病变结果 |
| 3.9 两株IBV体外培养增殖情况 |
| 3.10 SD/04/18 株多克隆抗体特异性验证 |
| 3.11 人工感染后的临床症状与剖检变化 |
| 3.12 病理组织变化 |
| 3.13 免疫组织化学法分析结果 |
| 3.14 两组试验鸡的体重差异 |
| 3.15 各器官不同时间点病毒载量的动态变化 |
| 3.16 相同时间点各器官病毒载量的比较 |
| 3.17 SD/04/18 株的排毒规律 |
| 3.18 抗体水平检测结果 |
| 4.讨论 |
| 4.1 SD/04/18 株分离鉴定与遗传进化分析 |
| 4.2 IBV实时定量PCR检测方法建立与应用 |
| 4.3 SD/04/18 株和M41 株的体外增殖分析 |
| 4.4 SD/04/18 株的致病性与排毒规律 |
| 4.5 SD/04/18 株在各组织器官的动态分布与宿主抗体水平的关系 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间的主要学术成果 |
（10）新城疫多联疫苗研究进展（论文提纲范文）
| 1 以新城疫为基础的病毒类联苗 |
| 1.1 以新城疫为基础的二联疫苗 |
| 1.1.1 新城疫与传染性支气管炎联苗 |
| 1.1.2 新城疫与减蛋综合征联苗 |
| 1.1.3 新城疫与禽流感联苗 |
| 1.1.4 新城疫与传染性法氏囊病联苗 |
| 1.2 以新城疫为基础的三联疫苗 |
| 1.3 以新城疫为基础的四联疫苗 |
| 2 新城疫与细菌类联合疫苗 |
| 3 展望 |
四、鸡传染性支气管炎肾型弱毒株J_9的安全性试验（论文参考文献）
- [1]GVI-1型传染性支气管炎病毒的RT-qPCR检测方法建立、致病性评价和弱毒疫苗株培育[D]. 陈淑琴. 扬州大学, 2021
- [2]表达IBV纤突蛋白的ILT重组病毒构建及其免疫效果评价[D]. 盛洁. 中国农业科学院, 2021
- [3]TW Ⅰ型传染性支气管炎病毒“保护型”疫苗组合的筛选和弱毒疫苗的研制[D]. 杜旭彬. 扬州大学, 2021
- [4]河北部分地区IBV分离株的基因序列分析及其间接ELISA方法的初步建立[D]. 周琦. 河北科技师范学院, 2020(12)
- [5]TW Ⅰ型传染性支气管炎病毒的致病性评价与实时荧光定量PCR检测方法的建立[D]. 廖凯. 扬州大学, 2020
- [6]2016-2018年IBV分子流行病学及TW型IBV弱毒疫苗的研究[D]. 陈彤. 华南农业大学, 2019
- [7]应对日益严峻的挑战:中国禽传染性支气管炎研究[J]. 黄梦姣,张芸,薛春宜,曹永长. 微生物学通报, 2019(07)
- [8]两株鸡传染性支气管炎病毒的分离、全基因组测序及其S1基因的克隆表达[D]. 张琳婧. 扬州大学, 2019
- [9]传染性支气管炎病毒SD/04/18株感染鸡体内各组织中病毒的动态分布及排毒规律研究[D]. 潘力. 山东农业大学, 2019(01)
- [10]新城疫多联疫苗研究进展[J]. 汪宏才,温国元,罗青平. 湖北农业科学, 2018(24)
标签：基因型论文; 鸡传染性支气管炎论文; 支气管炎论文; 血清蛋白论文; 基因合成论文;