一、Differential Expression of Genes during Somatic Embryogenesis in Upland Cotton（论文文献综述）
束立哲,宫则宇,雷忠萍,唐保善,卢碧霞,宋银,贺道华[1]（2021）在《陆地棉BABY BOOM基因的克隆及特征分析》文中研究表明BABY BOOM （BBM）是植物特有的AP2/ERF （APETALA2/ethylene-responsive factor）家族转录因子,在体细胞胚胎发生过程中发挥重要的调控作用。本研究利用同源克隆技术从陆地棉（Gossypium hirsutum）品种’豫早1号’（YZ-1）中克隆到GhBBMa （GenBank No. MW836956）和GhBBMd （GenBank No.MW836957）两个基因,结合3个自然群体的重测序数据和表型数据,以及中棉所24号（ZM24）的基因组数据,通过软件分析BBM基因的DNA序列及其编码的蛋白等特征;通过RNA-seq数据和qRT-PCR实验分析BBM基因表达特征。结果表明,GhBBMa/d分别位于A08和D08染色体上,均由9个外显子组成,长度分别为2 028 bp、2 025 bp,分别编码675、674个氨基酸。GhBBMa/d氨基酸序列含有2个保守的AP2结构域,无信号肽和跨膜结构;亚细胞定位结果显示其位于细胞质中。系统发育树显示,GhBBMa/d与同属锦葵目的可可树（Theobroma cacao）亲缘关系最近。自然群体的重测序数据表明,GhBBMa和GhBBMd的序列多态性分别为1.222和1.422 SNP/kb,连锁不平衡（linkage disequilibrium, LD）衰减距离为5.54、12.76 kb,说明GhBBMd比GhBBMa受到更强烈的选择压;关联作图显示,GhBBMa/d对马克隆值等性状有显着的表型效应。RNA-seq数据表明GhBBMa/d均在根和胚珠中表达量较高,在其他时空条件下不表达或表达很低;与非胚性愈伤相比,GhBBMd在胚性愈伤中显着高量表达。qRT-PCR实验显示GhBBMa/d均在30 d的胚性愈伤和开花前三天（-3 days post anthesis, DPA）的胚珠中表达量最高。综上所述,本研究克隆的GhBBMa和GhBBMd具有表型效应,在胚胎发生过程中的不同时期表达量不同,可能在体细胞胚胎发生及胚珠发育过程中行使重要的功能,为进一步探究GhBBM参与体细胞胚胎发生过程的分子机制提供参考。
李健英[2]（2019）在《棉花响应烟粉虱胁迫的分子机制及棉花体细胞胚胎表观基因组学研究》文中提出棉花作为全球三大转基因作物之一,其纤维品质和产量受到农业害虫的影响。随着转Bt基因棉花推广,鳞翅目害虫棉铃虫、红铃虫得到控制,但其抗性逐渐丧失。烟粉虱（Bemisia tabaci）等刺吸式口器害虫对全球棉花生产造成了巨大的危害,但关于棉花如何感知和防御烟粉虱的信息是非常有限的。本研究以棉花与烟粉虱互作为模型,利用RNA-Seq和sRNA-Seq数据挖掘棉花内源的抗虫机制,构建棉花响应烟粉虱非编码RNA共表达调控网络。在全基因组水平上,利用全基因关联分析（GWAS）挖掘棉花抗性位点。为了更好地进行棉花遗传转化,拓展棉花遗传转化的受体范围,我们建立了连续再生驯化体系,获得了高转化效率棉花受体材料-Jin668,同时系统解析棉花再生和体细胞胚胎发生表观遗传调控机制。因此本研究分两大部分内容,分别探讨棉花内源的抗虫基因鉴定和功能分析以及棉花再生DNA甲基化图谱。主要结果如下:1.棉花-烟粉虱互作转录组分析利用RNA-Seq比较了烟粉虱强抗性品种（HR）和敏感性品种（ZS）在不同侵染时间点转录组差异。功能富集分析表明棉花对烟粉虱侵染的转录反应涉及编码蛋白激酶、转录因子、代谢物合成和植物激素信号的基因。结合GO和KEGG富集分析,HR和ZS感染烟粉虱后抗性基因的转录水平不同。RNA-Seq数据集构建的加权基因共表达网络显示WRKY40和铜转运蛋白是棉花响应烟粉虱侵染的枢纽基因。通过病毒诱导的基因沉默（VIGS）研究GhMPK3,抑制了MPK-WRKY-JA通路,增强烟粉虱的易感性。本研究为棉花防御烟粉虱响应提供了全面见解,并鉴定了几类控制韧皮部害虫的候选基因。2.棉花响应烟粉虱非编码RNA分子机制解析本研究我们构建了抗性材料（HR）和易感材料（ZS）在烟粉虱侵染下小RNA和降解组测序。总共鉴定出260个miRNA家族和241个靶标。定量PCR分析显示几种miRNA及其相应的靶标呈现出动态的时空表达模式。在RNA-Seq数据集鉴定了2,365个基因间区长链非编码RNA（lincRNAs）。进一步分析发现29个lincRNA转录本中产生17个miRNA前体。全基因组分析鉴定出85个同相位干扰小RNA（phasiRNA）位点,9个PHAS基因由6个miRNA触发,包括编码富含亮氨酸重复序列（LRR）的抗病蛋白,生长素响应因子（ARF）和MYB转录因子。通过构建模型和实验数据,我们探索和扩展了miR390-tasiARF在棉花响应烟粉虱侵染转录调控机制。VIGS沉默ARF8增加了生长素和茉莉酸,导致对烟粉虱侵染耐受性增加。通过对不同的非编码RNA进行综合分析,为植虫互作提供了有用的转录组数据资源。3.关联分析挖掘棉花抗虫位点本研究收集了269份陆地棉材料组成的自然群体,鉴定了2.88百万SNPs并进行群体进化树,群体结构,PCA分析和连锁不平衡分析。269份棉花材料在三个环境中进行棉花四个抗虫指数调查,叶片危害率（LDR）,整体植株危害率（PDR）,感抗等级（SRL）以及盲蝽蟓指数（MI）。我们在三个环境下鉴定了7个LDR,PDR和SRL显着候选位点,其中有一个位点共定位。结合LD分析,整合转录组数据,筛选了一个铜转运子CRC1候选基因。4.多组学数据揭示棉花再生和体细胞胚发育表观基因组学基础本研究通过连续再生驯化（SRA）策略,从母体自交系Y668中选育出具有高再生能力的优质棉花Jin668。我们构建了体细胞胚胎发育过程中的非胚性愈伤组织（NEC）,胚性愈伤组织（EC）,体细胞胚（SE）以及再生后代植株的叶片全基因组单碱基分辨率甲基化图谱。结果表明,Jin668显示出低DNA甲基化,再生后代中整体甲基化呈下降趋势。在NEC到EC中DNA甲基化上升由RNA介导的DNA甲基化（RdDM）和H3K9me2途径协同调控。在EC到SE中DNA甲基化下降,24-nt siRNA和H3K9me2丰度不变,进一步分析发现DNA去甲基化酶ROS1和DME显着上调,该过程可能依赖于DNA去甲基化途径。整合RNA-Seq和差异甲基化区域（DMR）,体细胞胚胎发生过程中低CHH-DMR激活了生长素和WUSCHEL相关基因表达。在NEC中添加DNA甲基化抑制剂增加了胚胎的数量。我们多组学数据为植物组织培养和再生后代植物中DNA甲基化的动态提供了新的见解。该研究还表明诱导的低甲基化可以更好的促进植物再生能力并优化母本遗传栽培品种。
魏喜[3]（2019）在《GhWOX11/12基因和红蓝光质对棉花体细胞胚胎发生的影响》文中指出棉花是世界上重要的经济作物、纤维作物、油料作物,棉花许多优良的农艺性状都是通过转基因获得,许多植物分子育种依赖于植物组织培养,然而有些棉花品种由于受到基因型的限制,难以通过植物组织培养得到再生棉花,只有个别棉花品种可以。因而,如何提高棉花转基因效率就显得尤为重要,棉花体细胞胚胎发生主要经历4个过程:愈伤诱导阶段,胚性愈伤诱导阶段,体细胞胚诱导阶段和再生苗阶段。前期棉花体胚发生时愈伤的质量与再分化和体胚的形成关系密切,WOX11/12基因激活WOX5和LBD基因从而促进具有根原基属性的PSCs的形成;在环境方面主要设置不同红蓝配比为B﹕R=1﹕1、B﹕R=3﹕1、B﹕R=1﹕3和DL的光质组合,探索其对棉花体细胞胚胎发生4个阶段的影响,本研究分别从环境和基因两个方面研究其对棉花体细胞胚胎发生的影响。主要研究结果如下:1.生长素的非对称分布激活Gh WOX11和Gh WOX12的差异表达根据棉花下胚轴愈伤起始的表型,选择愈伤诱导0 h,24 h,48 h,60 h,72 h,136h下胚轴进行转录组测序和不同处理后内源生长素含量的测定以及表达量的检测。结果发现生长素的非对称分布引起了Gh WOX11和Gh WOX12的差异表达,从而促进愈伤的形成。2.Gh WOX11和Gh WOX12同时调节愈伤组织和不定根的形成在不添加外源生长素的情况下,构建过表达载体转化7天苗龄大小的棉花下胚轴,90天后,在过表达35S::Gh WOX11＿Dt和35S::Gh WOX12＿Dt载体中,我们发现每个下胚轴切段外植体平均可形成3个不定根,而空载体中每个下胚轴外植体平均只能形成一个不定根。过表达35S::Gh WOX11＿Dt和35S::Gh WOX12＿Dt形成的不定根数量与Mock相比差异显着。3.过表达基因Gh WOX11和Gh WOX12显着促进陆地棉愈伤组织的形成分别用构建好的35S::Gh WOX12＿Dt和35S::Gh WOX11＿Dt载体以及空载体Mock转化CCRI24棉花下胚轴,通过对棉花体细胞胚胎发生愈伤阶段和胚性愈伤阶段的35S::Gh WOX12＿Dt和35S::Gh WOX11＿Dt和Mock载体转化体的观察分析和统计,我们发现整体上过表达基因Gh WOX11和Gh WOX12显着促进陆地棉体细胞胚胎发生脱分化和再分化过程。4.嵌合的Gh WOX11和Gh WOX12抑制子抑制胚性愈伤组织的形成将Gh WOX11和Gh WOX12基因与一个抑制结构域SRDX融合形成一个嵌合的Gh WOX11和Gh WOX12抑制子并转化棉花下胚轴,发现整体上嵌合基因Gh WOX11和Gh WOX12抑制子显着抑制陆地棉体细胞胚胎发生脱分化和再分化过程,基因Gh WOX11和Gh WOX12通过影响脱分化愈伤的质量,进而调控再分化成胚性愈伤组织,使细胞命运发生极大的转变。5.红蓝配比为B﹕R=1﹕3的光质组合在整体上能促进棉花体细胞胚胎的发生与B﹕R=1﹕3和DL光质组合相比,B﹕R=1﹕1和B﹕R=3﹕1的光质组合均显着促进了愈伤的增殖率,但抑制体细胞胚长出下胚轴;与B﹕R=1﹕1和B﹕R=3﹕1相比,B﹕R=1﹕3和DL光质组合均促进胚性愈伤分化和诱导体细胞胚的产生,在诱导下胚轴生根方面,B﹕R=1﹕1组合生根率明显高于其他3种处理;B﹕R=1﹕3和B﹕R=1﹕1处理后下胚轴成苗数、植株高度和叶绿素浓度明显高于B﹕R=3﹕1和DL光质组合,B﹕R=1﹕3的促进效果最明显。
徐娇[4]（2018）在《棉花体细胞胚胎发生相关基因GhL1L1的克隆和功能验证》文中认为体细胞胚胎发生是植物体细胞不经过双受精在体外培养再生成为胚并发育成为一棵完整植株的过程。随着棉花组织培养及转基因技术的发展,棉花体细胞胚胎发生成为棉花遗传转化技术的基础。生长素是体细胞胚胎发生重要的调节因子之一。在本实验室前期的体胚发生表达谱中发现一个差异表达的NF-YB类转录因子,GhL1L1,该基因在棉花体细胞胚胎发生过程中差异表达。本研究对GhL1L1在棉花体细胞胚胎发生中的功能进行研究,结果如下:1、陆地棉GhL1L1的克隆及表达分析根据棉花体细胞胚胎发生过程的表达谱分析结果,我们克隆到陆地棉GhL1L1基因,编码NF-YB亚家族的蛋白;陆地棉TM-1全基因组存在41个NF-YB亚家族的基因,根据同源性比对结果,有6个属于LEC1类,其余为非LEC1类;6个LEC1类的NF-YB基因分别分布在A和D亚基因组上,编码3个同源的蛋白。组织表达模式分析发现LEC1类的NF-YB基因主要在开花后20天的种子、胚性愈伤组织、体细胞胚和合子胚等胚性细胞组织中表达,其中,GhL1L1（GhD05G1686）在胚性细胞组织中的表达量最高。2、陆地棉GhL1L1调控棉花体细胞胚胎发生过程中的细胞命运为了验证GhL1L1在棉花体细胞胚胎发生过程中的功能,我们构建了超表达和干涉表达载体并转化棉花。结果发现超表达GhL1L1抑制非胚性愈伤组织的起始和增殖,外植体的极性生长状态不明显,超表达GhL1L1促进胚性愈伤组织的产生及体细胞胚的发生,伴随着胚性细胞形成的标志基因Gh FUS3和Gh ABI3的表达量显着升高。GhL1L1干涉株系愈伤组织增殖率与对照相比差异不大,外植体愈伤组织的生长出现明显的极性生长,但GhL1L1干涉株系胚性愈伤产生的时间明显推迟。3、陆地棉GhL1L1影响棉花体细胞胚胎发生过程中生长素的积累和分布为了研究GhL1L1与生长素之间的关系,我们检测了GhL1L1转基因和对照株系诱导培养25 d、40 d的外植体和胚性愈伤组织中的生长素含量,结果显示超表达GhL1L1诱导25 d和40 d的外植体中的生长素含量显着高于对照和干涉株系;此外,在GhL1L1超表达株系胚性愈伤组织生长素的含量显着高于阴性对照,而GhL1L1干涉株系胚性愈伤组织生长素的含量显着低于阴性对照。为了研究GhL1L1与生长素分布的关系,GhL1L1转基因和阴性对照株系与DR5::GUS株系进行杂交,在超表达GhL1L1的茎顶端分生组织中GUS染色较深,有较多的生长素积累;通过GUS染色切片和IAA免疫荧光切片观察发现,在超表达和抑制表达GhL1L1的鱼雷胚中生长素的分布均会受到不同程度的影响。4、陆地棉GhL1L1与GhPP2AA2结合调控Gh PIN1蛋白的表达酵母单杂交和双荧光素酶报告基因检测系统实验验证,GhL1L1可以与GhPP2AA2启动子区域的G-box元件结合,调控其表达。此外,通过体外pull-down实验和体内Bi FC及蛋白共定位实验证明,GhPP2AA2可以与Gh PIN1蛋白相互作用,GhPP2AA2蛋白与拟南芥At PP2AA2蛋白较为同源,At PP2AA2可以去磷酸化PIN1蛋白,影响PIN1蛋白的磷酸化状态和定位。因此,GhL1L1可能通过GhPP2AA2调控Gh PIN1蛋白的活性而影响生长素的极性运输和分布。5、抑制生长素的极性运输可以促进棉花体细胞胚胎发生为了确定Gh PIN1蛋白的定位改变是否会影响棉花的体细胞胚胎发生,在GhL1L1转基因和阴性对照外植体诱导培养基中添加生长素运输抑制剂TIBA。结果发现,TIBA可以影响生长素的分布,抑制愈伤组织的增殖,诱导培养15 d GhL1L1转基因和阴性对照外植体的愈伤增殖没有明显的差异;同时,TIBA处理可以促进胚性愈伤组织细胞的提前分化,特别是在GhL1L1的干涉株系至少提前10天出现胚性愈伤组织,GhL1L1转基因和阴性对照株系外植体愈伤组织的分化率都有一定的提高。6、陆地棉GhL1L1调控脂肪酸的合成在棉花体细胞胚胎发生过程中超表达GhL1L1可以增加棉花亚油酸的含量。为了进一步研究GhL1L1的调控机理,我们通过酵母双杂交和免疫沉淀质谱分析（IP-MS）的方法鉴定GhL1L1相互结合的蛋白,通过Pull-down,Bi FC和Co-IP实验验证GhL1L1与Gh NF-YC2和Gh NF-YC9相互作用,GhL1L1与Gh NF-YC2可以与Gh SSI2的启动子结合,推测GhL1L1通过调控Gh SSI2影响脂肪酸的合成。
王丽晨[5]（2017）在《陆地棉体细胞胚胎发生过程中miRNAs及其靶标的鉴定和GhmiR157a/GhSPL10功能分析》文中研究指明体细胞胚胎发生体系是研究已分化组织和器官脱分化和再分化的良好模型,也是植物转基因技术的重要依托,对于其机制的研究具有重要的理论和应用价值。micro RNAs（mi RNAs）是一类长度通常为19-25个核苷酸（nt）的内源非编码RNA,在植物的生长发育,激素信号转导,逆境胁迫响应等方面起着重要的作用。然而棉花中关于mi RNAs的研究较少;本研究基于实验室前期筛选的一个高效体细胞胚胎发生的材料YZ1,利用小RNA测序结合降解组测序,鉴定棉花体细胞胚胎发生过程中的小RNA及其靶标基因,研究他们在体细胞胚胎发生过程中的动态调控,综合阐述小RNA及其靶标基因在棉花体细胞胚胎发生中的调控作用;并进一步探讨棉花中Ghmi R157a及其靶标Gh SPL10在棉花脱分化过程中的生物学功能。主要研究结果如下:1、棉花体细胞胚胎发生相关mi RNAs及其靶标基因的挖掘与鉴定本研究构建了YZ1胚性愈伤（EC）和下胚轴（CK,对照）的小RNA测序文库。发现36个家族的保守mi RNAs在两个样品间差异表达,发现属于19个家族的29条保守mi RNAs的前体,同时发现了25个新的mi RNAs及其前体。这些mi RNAs的长度主要集中在19 nt到24 nt之间,21 nt的占了约80%。同时利用降解组测序,在EC中共发现234个转录本被23个保守mi RNAs家族成员所剪切,在CK中共发现322个转录本被30个保守mi RNAs家族成员所剪切,同时发现16个转录本被8个新的mi RNAs所剪切。这些保守靶标中包括转录因子、激素信号以及逆境信号相关的基因。此外本研究还发现4个TAS3转录本产生的tasi RNAs及其靶标AFR3/4。5’RACE技术证实大部分保守mi RNA能够诱导它们保守的靶标转录本被剪切降解,这说明降解组测序的结果是比较可靠的。mi RNA和靶标表达模式分析发现,mi R156及其靶标SPL9,mi R169及其靶标NF-YA3和mi R396及其靶标GRF8在棉花体细胞胚胎发生过程中具有明显的负相关性,据此推测这些mi RNAs可能通过负调控相应的靶标进一步调控下游信号路径,从而参与调控陆地棉体细胞胚胎发生过程。2、Ghmi R157a/Gh SPL10参与调控棉花体细胞胚胎发生过程体细胞胚胎发生过程中的表达分析发现Ghmi R157a及其靶标Gh SPL10在脱分化前期以及胚性再分化过程中均显示相反的表达趋势。进一步通过原位杂交发现Gh SPL10在外植体的形成层以及鱼雷胚的原维管组织表达,暗示Ghmi R157a和Gh SPL10可能通过调控形成层细胞分裂和分化来调控体细胞胚胎发生过程。通过转基因手段超表达Ghmi R157a和Gh SPL10,发现虽然超表达Ghmi R157a没有明显表型,但是超表达Gh SPL10能够提高愈伤增殖速率（callus proliferation rate,CPR）,并且导致胚性再分化提前。转基因系脱分化前期的石蜡切片显示Gh SPL10超表达造成维管束形态发生了变化,表现为木质部细胞小而多,且连续分布;外植体诱导3 d以后形成层细胞增多,并且细胞周期相关基因上调表达。这些结果说明Gh SPL10超量表达造成了形成层细胞分裂加快,从而提高了脱分化速率。3、Ghmi R157a/Gh SPL10通过调控乙烯信号路径和类黄酮生物合成路径来调控棉花体细胞胚胎发生为了进一步阐释超表达Gh SPL10脱分化加快的原因,本研究对阴性对照和Gh SPL10超量表达株系35S:r SPL10-7的下胚轴进行RNA-SEQ测序。通过对测序结果分析发现:1)Gh SPL10超表达系与对照相比,有1600多个差异表达的基因,其中1005个上调表达,633个下调表达;2)利用差异表达的基因进行GO和KEGG分析均发现类黄酮生物合成路径和植物激素信号路径显着富集;3)q RT-PCR验证了乙烯合成酶基因ACOs以及类黄酮合成相关基因在Gh SPL10超表达系中均上调表达;4)类黄酮含量测定发现Gh SPL10超表达系中不同种类的类黄酮与对照相比显着增加。35S:r SPL10-7与F3H干涉系Ri3杂交F1代愈伤增殖明显受抑制,并且在体外添加类黄酮之后恢复至野生型水平。对野生型外植体进行不同种类的类黄酮处理也能够促进愈伤增殖和细胞周期相关基因的表达。以上结果说明类黄酮在Gh SPL10超表达系中的过量积累是造成其愈伤增殖变快的主要原因。4、乙烯信号是导致类黄酮生物合成路径上调的主要因素之一。用乙烯合成抑制剂AVG处理35S:r SPL10-7外植体明显抑制其脱分化,而用乙烯前体ACC处理野生型外植体能够促进愈伤增殖,用乙烯合成的抑制剂AVG和Co Cl2,或者乙烯响应的抑制剂Ag2S2SO3处理则抑制脱分化,说明乙烯信号在Gh SPL10超表达系中的上调对愈伤增殖起到正向作用。另外,q RT-PCR的结果显示,ACC处理能够进一步激活35S:r SPL10-7中F3H的相对表达水平,而在r SPL10-7/F3H-Ri3外植体中F3H表达受到明显抑制,且ACC处理并不能进一步上调其表达水平,说明Gh SPL10超表达确实造成了乙烯介导的类黄酮生物合成路径的变化。另外在脱分化前期,通过ACC处理野生型或者超表达EIN2和干涉CTR1都能够造成类黄酮合成相关基因和类黄酮含量的增加,而Ag2S2SO3处理则在一定程度上降低类黄酮合成相关基因和类黄酮含量,说明乙烯信号的上调是导致Gh SPL10超表达系中类黄酮过量积累的因素之一。除了乙烯,生长素处理也能够促进脱分化前期类黄酮合成相关基因的表达。
郭家雁[6]（2017）在《海岛棉体细胞胚胎同步化发生的研究及GbAIL5、GbAGL15基因的克隆》文中提出海岛棉再生体系中存在体细胞胚胎同步化程度低、畸形胚比例高等亟待解决的问题。这些问题为深入研究海岛棉胚胎发育机理、扩大再生植株生产规模等工作造成不便,不利于开展农杆菌介导的海岛棉转基因研究。试验以新海16号的胚性愈伤组织为材料,探索了不同处理诱导新海16号的体细胞胚胎同步化发生的效果,为提高海岛棉体细胞胚胎发生的效率打基础。本试验克隆了植物胚胎发育相关基因GbAIL5和GbAGL15的编码区,研究了低温胁迫后它们在海岛棉胚性愈伤组织中的表达量变化,为后续深入开展海岛棉体细胞胚胎发育的分子机理研究做初步准备。试验得到的结果如下:（1）试验设置低温、营养胁迫、渗透胁迫三种处理方法,诱导新海16号的体细胞胚胎同步化发生,结果表明,4℃处理3 d有最佳的同步化诱导效果。（2）研究采用同源克隆的方法,得到海岛棉GbAIL5和GbAGL15基因的编码区序列,并对它们进行了生物信息学分析。分析结果显示,GbAIL5基因编码区长1626 bp,编码一段含541个氨基酸残基的蛋白质产物,该蛋白质内部包含2个AP2结构域,属于AP2转录因子家族成员。GbAGL15基因编码区长753 bp,编码一段含250个氨基酸残基的蛋白质。AGL15结构中含有1个MADS-MEF2-like区域和1个K-box保守区,该蛋白属于MADS-box转录因子家族。（3）利用实时荧光定量技术研究了低温胁迫后恢复28℃培养0-5 d内,海岛棉胚性愈伤组织中GbAIL5、GbAGL15基因的表达情况,结果显示:经过低温胁迫后,这两个基因的表达量都发生了改变。恢复28℃培养1 d,处理组GbAIL5的表达量显着高于对照组,但是在28℃培养2-3 d时处理组的表达量出现一个低谷,培养4 d和5 d后,处理组的GbAIL5表达量急速升高,与对照组的结果相比有极显着差异。处理组的GbAGL15基因表达量在28℃培养的1-4 d总体呈现上升趋势,培养到5 d时有所下降;处理组1-5 d的表达量都显着大于对照组,4 d和5 d的表达量与对照相比差异达到极显着水平。
李娟[7]（2017）在《GbWOX9基因植物表达载体的构建及对海岛棉胚性细胞的遗传转化》文中研究说明植物分生组织的干细胞是植物形态建成、器官持续再生的关键。WUS/WOX家族成员在植物分生组织的干细胞中特异表达,在植物器官发育过程中以及细胞类型转变中发挥着重要作用。本研究以海岛棉“新海16”为材料,克隆WOX/WUS转录因子家族的成员中与植物胚胎发育相关的基因GbWOX9,并对其进行结构预测分析、亚细胞定位预测、同源进化分析及不同体细胞胚阶段的表达分析,同时,构建化学诱导型的GbWOX9正、反义植物表达载体,借助农杆菌介导的遗传转化方法将GbWOX9基因导入到“新海16”的正、反义胚性细胞中并对其在不同诱导剂浓度处理过的细胞组织的表达模式进行分析。主要研究结果如下:1.利用PCR技术对GbWOX9基因进行克隆,借助相关的在线软件及DANMAN、MEGA5等对该基因进行生物信息学分析,结果表明该基因包括1038 bp的开放阅读框,编码345个氨基酸,在线预测其蛋白分子量约为38.26 kD,等电点为6.7。通过氨基酸序列比对发现,序列中含有一个保守的由65个氨基酸组成的DNA结合域,即同源异型结构域。系统进化树分析结果表明海岛棉GbWOX9蛋白与亚洲棉GaWOX9蛋白分布在同一分支上,说明二者在进化上亲缘关系较近。亚细胞定位预测GbWOX9可能定位于细胞核。qRT-PCR表明,该基因在“新海16”体细胞胚阶段的球形胚中表达量最高。2.构建了诱导型的正、反义植物表达载体pTA7002-GbWOX9和Anti pTA7002-GbWOX9,并进行了农杆菌遗传转化体系的优化研究。结果表明,对胚性细胞进行10 d的预培养OD600≈0.50.6,侵染时间为15 min,共培养24 h,抗性培养基中头孢和潮霉素的浓度分别为500 mg·L-1和20 mg·L-1时为转化效果较好。在加有抗生素的培养基上继代筛选两次以后,得到了转基因的阳性细胞。3.提取转化成功的海岛棉“新海16”正、反义植物表达载体胚性细胞的总RNA,利用荧光定量PCR检测GbWOX9的表达量。试验结果表明正、反义链的胚性细胞在30μmol·L-1的DEX浓度诱导之后,GbWOX9表达量皆与没有地塞米松诱导的对照之间有极显着差异（P<0.01）。
程文翰[8]（2016）在《棉花（Gossypium hirsutum L.）体细胞胚胎发生的生理及分子机制研究》文中研究说明目的:体细胞胚胎发生（Somatic embryogenesis）是棉花（Gossypium hirsutum L.）通过农杆菌介导的遗传转化最关键的步骤之一,通常包括非愈伤组织的诱导、胚性愈伤组织的分化、胚状体的形成以及胚状体发育成苗等过程。棉花体细胞胚胎发生存在的缺点是基因型依赖、培养周期长、不正常胚产生效率高,严重制约了棉花基因功能的验证和转基因育种工作。研究棉花体细胞胚胎发生的生理及分子机制可以为棉花组织培养及转基因育种工作提供重要的理论依据和技术支撑。方法:（1）本研究使用de novo转录组测序和iTRAQ蛋白组测序的方法,测定了新疆陆地棉品种新陆早33号体细胞胚胎发生过程中非胚性愈伤组织、胚性愈伤组织以及胚状体中的差异表达基因和蛋白,并对差异表达基因和蛋白进行了鉴定及表达模式分析。（2）对差异表达基因和蛋白的相关通路进行了注释和分类,进一步明确了参与调控棉花体细胞胚胎发生的通路。（3）利用qRT-PCR、内源含量测定以及外源添加等实验,明确相关基因、蛋白及通路与棉花体细胞胚胎发生的关系。（4）用HPLC法,提取分离鉴定了棉花内源多胺的种类,建立棉花组织多胺提取测定的技术体系。（5）通过分析多胺代谢途径相关生理生化指标、基因表达、ELISA法测定相关酶活性、生理互补实验等,揭示多胺调控棉花体细胞胚胎发生的可能机制。结果与结论:（1）De novo转录组测序一共获得了101,670个unigene,在胚性愈伤组织向胚状体转化过程中差异表达的基因多于非胚性愈伤组织向胚性愈伤组织转化过程中的差异表达基因。大量的差异表达基因参与了植物激素合成及信号转导、胁迫响应反应、ROS平衡以及多胺代谢等途径。用qRT-PCR验证了相关差异基因的真实性和准确性。内源IAA和KT含量变化规律与其合成途径相关基因的表达模式一致。外源IAA和KT能够促进胚性愈伤组织向胚状体的转化,不同浓度IBA的添加会对非胚性愈伤组织、胚性愈伤组织的诱导效率有影响,外源添加多胺和过氧化氢也能在很大程度上促进胚状体的形成。适当的胁迫条件对胚性愈伤组织的增殖以及胚状体形成都有促进作用。此外,赤霉素、脱落酸、乙烯、油菜素内酯、水杨酸、茉莉酸及脂肪酸途径相关基因也呈现出差异表达的规律。转录组动力学分析表明不同植物激素间的平衡调控,多胺代谢和胁迫响应过程协同调控了棉花体细胞胚胎发生。（2）iTRAQ蛋白组测序发现,三组样品中一共得到了5892个差异表达蛋白,这些蛋白主要参与了催化活性、结合活性、转运活性以及结构分子活性,其中93.4%的差异蛋白在分子功能水平参与了结构分子活性。差异表达蛋白统计分析发现,与非胚性愈伤组织相比,胚性愈伤组织中分别有572个上调表达蛋白和452个下调表达蛋白;与胚性愈伤组织相比,胚状体中分别有211个上调表达蛋白和647个下调表达蛋白。KEGG分析显示遗传信息的转运、植物激素合成及信号转导、糖酵解过程、脂肪酸合成和代谢以及半乳糖代谢等通路参与了棉花体细胞胚胎发生。通过qRT-PCR分析相关差异基因在三个时期的表达情况进一步确定了蛋白组测序的真实性和准确性。对转录组和蛋白组的测序数据进行关联分析发现,所测得基因序列和蛋白序列的关联系数为0.27,差异表达基因与差异表达蛋白的关联系数高于0.6。（3）建立了棉花组织多胺提取分离及测定的高效液相色谱法,可将腐胺、亚精胺、精胺在15分钟完全分离并定量测定,线性关系良好（r>0.99）,回收率高（96.8%103.1%）。测定棉花体细胞胚胎发生各时期内源多胺的含量,结果显示在胚性愈伤组织以及体细胞胚形成初期,三种类型多胺含量显着提高,腐胺的含量在胚状体中有下降趋势,而亚精胺和精胺的含量在胚状体中没有变化。多胺合成相关基因的表达量分析发现,棉花精氨酸合成酶GhADC在体细胞胚胎发生过程中的表达与多胺含量（尤其是腐胺含量）的变化规律非常一致。此外,多胺代谢产物H2O2的含量在胚性愈伤组织时期也有显着的提高,与多胺氧化酶GhPAO1和GhPAO4的表达规律一致。ELISA酶活测定发现,多胺氧化酶PAO在胚性愈伤组织中表现出较高的活性,抑制PAO活性则表现出体细胞胚胎形成受阻。多胺及其代谢产物H2O2都能够促进胚性愈伤组织的生长及胚状体的形成,同时也能够降低多胺合成抑制剂D-arginine及多胺氧化酶抑制剂1,8-DO的抑制效果。多胺代谢途径另一个重要的信号分子NO的含量在体细胞胚胎发生过程中变化不明显,且对体细胞胚胎发生没有显着作用。综合上面的结果,我们得出结论:多胺可能通过多胺氧化酶调节其代谢产物过氧化氢来调控棉花体细胞胚胎发生。
吴洁[9]（2016）在《茉莉酸促进棉花球形胚表皮细胞发育成体细胞胚的机理研究》文中提出棉花是一种重要的经济作物,长期以来,由于常规的棉花育种对目标性状的选择较费时费力,已不能满足市场需求,随着棉花细胞工程和基因工程研究的深入,给常规育种技术注入了新鲜血液,弥补了常规育种的不足,其中棉花的转基因育种技术发展尤为迅速。棉花的体细胞胚胎发生再生途径是研究棉花转基因技术的基础。我们研究发现,棉花体细胞胚形成的前期,特别是在球形胚时期,培养基中添加茉莉酸能使原球形胚产生大量的次生胚。本论文针对这一现象进行了系统研究。为我们使用球形胚为外植体进行农杆菌介导转化基因提供实际可能性。1.茉莉酸在合适浓度下,能促进球形胚类表皮细胞发育成体细胞胚。通过体视显微镜、扫描电镜、石蜡切片观察经茉莉酸处理的球形胚,发现次生胚是从球形胚的类表皮细胞发育而来,主要发生位置在胚轴部位。次生胚与原球形胚的组织学观察及后续发育均无显着差异,均可以发育为再生植株;2.JA合成途径限速酶AOS在体细胞胚发育中的表达分析。JA在调控棉花体细胞胚增殖方面有重要作用,而AOS是植物JA合成途径中的关键酶。我们鉴定了在胚发育过程中表达的AOS基因,依据荧光定量分析结果,可以将这些基因的表达模式主要分为3类,一类是GhAOS1和GhAOS6在棉花胚发育过程中表达量相对较高,另一类是GhAOS2和GhAOS3在棉花愈伤和胚性愈伤中表达量相对较高,第三类是GhAOS4和GhAOS5在茎和叶中表达水平相对较高。这些基因的表达有时空特异性,且GhAOS1和GhAOS6可能在棉花胚发育中发挥重要作用。亚细胞定位分析显示,大部分基因被定位在过氧化物酶体中,可能参与调控光呼吸、体细胞胚成熟和萌发。对其启动子元件分析发现,它们可能受激素和胁迫的调控在体细胞胚胎发生中起作用。为进一步研究AOS基因家族在棉花体细胞胚发育中的功能奠定了基础;3.通过对AOS基因的染色体位置、亚细胞定位、启动子和表达模式等的生物信息学分析,筛选出3个AOS基因GhAOS1、GhAOS2和GhAOS6,克隆基因,构建过表达载体转入棉花。同时构建VIGS干涉载体干涉棉花,我们发现无论是过表达AOS抑或是干涉AOS基因,球形胚发育成次生胚的数量均没有显着差异,说明球形胚表皮细胞再发育成体细胞胚与AOS基因表达量关系不密切;4.JA处理球形胚后进行转录组测序,分析发现差异基因在0.5h时最多,且上调基因数大于下调基因数;与逆境胁迫相关的差异基因较为突出,尤其是激素相关的基因;逆境响应的差异基因与生长素、脱落酸、乙烯密切相关;我们主要针对激素响应相关基因、压力响应相关基因以及体胚发育相关基因做了初步分析,推测JA处理球形胚产生次生胚可能通过与其他激素互作调节体细胞胚发育。
郑武[10]（2014）在《陆地棉体细胞胚胎发生关键基因挖掘及机理研究》文中研究指明植物体细胞胚胎发生是离体研究合子胚发育机制的理想模型。棉花转基因技术中，基于体细胞胚胎发生的农杆菌介导法是应用最广泛的技术之一。目前棉花体细胞胚胎发生依然比较困难，其中愈伤组织如何高效快速的分化为胚性愈伤组织是主要技术瓶颈。只有少数品种可以实现高效快速的分化，大多数品种表现为难分化或不分化。这一难题严重限制了转基因技术在更广泛品种上的应用。因此寻找控制棉花体细胞胚胎发生过程分化的关键基因并研究其分子机制就显得尤为重要。本实验从转基因角度出发，通过农杆菌介导法将目的基因转入棉花以验证目的基因在棉花愈伤组织分化为胚性愈伤组织时期的功能，并取得了以下实验结果：（1）利用实验室已经构建好的抑制性消减杂交（SSH）文库数据，寻找到在胚性愈伤组织时期表达量相对较高的目的基因GhSERK1和GhMAPK16，并通过电子克隆和基因组数据克隆到编码区。将这些基因构建过表达载体转化陆地棉品种CRI24，结果发现GhSERK1确实在胚性愈伤组织时期的表达量呈现高峰；过表达GhSERK1不能从本质上提高愈伤组织分化率但可以加快愈伤组织形成胚性愈伤组织的进程。而GhMAPK16在胚性愈伤组织时期的表达量并没有呈现高峰，而且过表达该基因也没有任何表型。（2）利用已证明能促进拟南芥胚性愈伤组织形成的基因AtWuschel，构建过表达载体转化陆地棉难分化材料CRI12。结果发现CRI12的分化率从0.61%提高到47.75%，极大的提高了该材料的愈伤组织分化率。在此基础上，我们进一步探讨了该基因促进体细胞胚胎发生的分子机制，结果发现AtWuschel极有可能是通过激活生长素信号通路进而使得生长素下游的体细胞胚胎发生潜能基因GhLEC1、GhLEC2和GhFUS3得到激活来行使其功能的。为了进一步验证GhLEC1、GhLEC2和GhFUS3的功能，我们构建了一个同时干涉GhLEC1、GhLEC2和GhFUS3的干涉载体，并转化高分化率材料CRI24，结果发现CRI24的分化能力也受到严重抑制。（3）为了能更广泛的筛选到控制体细胞胚胎发生的关键基因，构建了愈伤组织到胚性愈伤组织全生育期的过表达的cDNA全长均一化文库（全长cDNA质粒穿梭文库），为以后将整个文库通过农杆菌介导法转化棉花来大规模筛选关键基因奠定了基础。综上所述，候选的三个基因中，AtWuschel能显着提高愈伤组织的分化率。生长素和细胞分裂素信号通路基因及其下游基因GhLEC1、GhLEC2和GhFUS3的表达量在高分化材料愈伤组织（CRI24）和难分化或不分化材料（CRI12、CRI41、Lu28）的愈伤组织间存在明显差异。而AtWuschel可能正是通过调节这些通路和下游基因才使得难分化材料CRI12的分化率提高。这表明生长素和细胞分裂信号通路以及GhLEC1、GhLEC2和GhFUS3在控制愈伤组织分化能力上起着非常重要的作用。
二、Differential Expression of Genes during Somatic Embryogenesis in Upland Cotton（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Differential Expression of Genes during Somatic Embryogenesis in Upland Cotton（论文提纲范文）
（1）陆地棉BABY BOOM基因的克隆及特征分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料及主要试剂 |
| 1.2 棉花总RNA提取及c DNA合成 |
| 1.3 引物设计与棉花BABY BOOM基因的克隆 |
| 1.4 核苷酸序列分析与关联作图 |
| 1.5 氨基酸序列与蛋白特征分析 |
| 1.6 陆地棉BABY BOOM基因的表达特征分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 陆地棉Gh BBM基因克隆和及序列分析 |
| 2.2 陆地棉Gh BBM基因的序列多样性分析和5份棉花材料的聚类 |
| 2.3 连锁不平衡及关联作图 |
| 2.4 Gh BBM氨基酸序列(蛋白)特征、同源性比对及系统发育树分析 |
| 2.5 Gh BBM蛋白的高级结构预测 |
| 2.6 Gh BBM基因表达特征分析 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（2）棉花响应烟粉虱胁迫的分子机制及棉花体细胞胚胎表观基因组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物与害虫互作研究综述 |
| 1.1.1 转基因抗虫作物研究概况 |
| 1.1.2 植物—昆虫互作分子机制 |
| 1.2 植物抗虫基因挖掘手段 |
| 1.2.1 Bt毒蛋白杀虫 |
| 1.2.2 来源于植物抗虫基因 |
| 1.2.3 RNAi在植物抗虫中的应用 |
| 1.2.4 组学技术挖掘植物抗虫基因 |
| 1.2.5 正向遗传学挖掘植物抗虫基因 |
| 1.3 植物非编码RNA研究进展 |
| 1.3.1 非编码RNA研究概述 |
| 1.3.2 非编码RNA在植物抗病虫研究进展 |
| 1.4 植物表观基因组研究进展 |
| 1.4.1 主要表观修饰因子 |
| 1.4.2 DNA甲基化表观遗传机制 |
| 1.4.3 DNA甲基化与植物有性生殖 |
| 1.4.5 DNA甲基化与杂种优势 |
| 1.4.6 DNA甲基化与群体遗传学 |
| 1.5 植物再生研究进展 |
| 1.5.1 棉花再生研究进展 |
| 1.5.2 植物再生表观调控 |
| 1.6 本研究目的和意义 |
| 第二章 棉花响应烟粉虱侵染的转录组分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 棉花材料 |
| 2.1.2 昆虫来源 |
| 2.1.3 棉花接虫方法 |
| 2.1.4 棉花抗烟粉虱指标统计 |
| 2.1.5 棉花RNA提取和测序 |
| 2.1.6 数据质控和比对 |
| 2.1.7 差异表达基因分析 |
| 2.1.8 共表达网络分析 |
| 2.1.9 RT-PCR和 qPCR-PCR |
| 2.1.10 VIGS载体构建和侵染 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 烟粉虱侵染棉花表型统计 |
| 2.2.2 烟粉虱侵染抗感棉花材料转录谱构建 |
| 2.2.3 烟粉虱侵染棉花转录谱全局变化 |
| 2.2.4 差异表达基因分析 |
| 2.2.5 差异表达基因功能富集分析 |
| 2.2.6 差异表达基因的共表达网络构建 |
| 2.2.7 重要基因表达分析 |
| 2.2.8 VIGS验证候选基因 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 棉花响应烟粉虱非编码RNA分子机制解析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 长链非编码RNA鉴定 |
| 3.1.3 长链非编码RNA功能分析 |
| 3.1.4 sRNA和降解组文库构建 |
| 3.1.5 miRNA鉴定及差异表达分析 |
| 3.1.6 miRNA及其靶标的鉴定 |
| 3.1.7 5'RACE技术验证靶基因切割位点 |
| 3.1.8 茎环PCR定量miRNA表达量 |
| 3.1.9 phasiRNA鉴定 |
| 3.1.10 植物激素测定 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 全基因组鉴定长链非编码RNA |
| 3.2.2 全基因组鉴定miRNA及其前体 |
| 3.2.3 长链非编码RNA功能分析 |
| 3.2.4 miRNA靶基因鉴定和功能分析 |
| 3.2.5 miRNA介导的phasiRNA在棉花响应烟粉虱转录反应 |
| 3.2.6 miR390-tasiARFs参与棉花对烟粉虱转录响应 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 关联分析挖掘棉花响应虫害基因 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 棉花抗感虫表型调查与评价 |
| 4.1.3 基因型检测 |
| 4.1.4 群体结构和连锁不平衡 |
| 4.1.5 关联分析 |
| 4.1.6 候选基因预测 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 基因型和群体结构分析 |
| 4.2.2 表型变异 |
| 4.2.3 抗虫关联分析 |
| 4.2.4 候选基因预测 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 棉花再生和体细胞胚发育表观基因组学图谱 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 受体材料选择 |
| 5.1.2 连续再生棉花转化母体材料 |
| 5.1.3 甲基化抑制剂处理Jin668 愈伤组织 |
| 5.1.4 重亚硫酸氢盐文库构建 |
| 5.1.5 BS-Seq数据分析 |
| 5.1.6 RNA-Seq测序与数据分析 |
| 5.1.7 Small RNA测序与数据分析 |
| 5.1.8 染色质免疫共沉淀(ChIP) |
| 5.1.9 ChIP-Seq数据分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 不同世代棉花再生效率的比较 |
| 5.2.2 SRA不同世代和体细胞胚胎发育过程全基因组DNA甲基化谱 |
| 5.2.3 SRA不同世代与野生型全基因甲基化的比较 |
| 5.2.4 Jin668 体细胞胚胎发生不同阶段甲基化动态变化 |
| 5.2.5 RdDM途径和H3K9me2 途径协同建立CHH甲基化 |
| 5.2.6 DNA甲基化动态变化调控体细胞胚胎发育 |
| 5.2.7 NEC中低甲基化调控重要功能基因表达 |
| 5.2.8 组织培养抑制甲基化激活激素相关基因表达促进胚胎发生 |
| 5.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间已发表和待发表论文 |
| 致谢 |
（3）GhWOX11/12基因和红蓝光质对棉花体细胞胚胎发生的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 植物体胚发生国内外研究进展 |
| 1.1.1 植物体胚发生 |
| 1.1.2 植物体胚发生的关键基因 |
| 1.1.3 植物激素与棉花体胚发生的关系 |
| 1.2 多能干细胞(PSCs) |
| 1.3 光质 |
| 1.4 本课题研究的目的和意义 |
| 2 GhWOX11和GhWOX12基因的克隆及其对棉花体细胞胚胎发生的影响 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 载体及菌株 |
| 2.1.3 试验试剂 |
| 2.1.4 试验仪器 |
| 2.1.5 培养基 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 棉花组织培养 |
| 2.2.2 棉花总RNA的提取和反转录合成c DNA |
| 2.2.3 转录组测序 |
| 2.2.4 植物内源生长素含量的测定 |
| 2.2.5 荧光定量PCR(q RT-PCR) |
| 2.2.6 Gh WOX11和Gh WOX12 基因的克隆和载体的构建 |
| 2.2.7 嵌合的Gh WOX11和Gh WOX12抑制子表达载体的构建 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 WOX11和WOX12 基因在拟南芥和棉花中的序列和结构域分析 |
| 2.3.2 棉花体细胞胚胎发生愈伤起始时期的转录组分析 |
| 2.3.3 愈伤起始阶段生长素合成相关的差异基因的表达是丰富的 |
| 2.3.4 愈伤起始阶段生长素信号通路相关基因的表达情况 |
| 2.3.5 棉花体细胞胚胎发生愈伤起始期的形态学特点 |
| 2.3.6 生长素的极性分布调控细胞命运转变 |
| 2.3.7 Gh WOX11和Gh WOX12同时调节愈伤组织和不定根的形成 |
| 2.3.8 过表达基因Gh WOX11和Gh WOX12显着促进陆地棉愈伤组织的形成 |
| 2.3.9 嵌合的Gh WOX11和Gh WOX12抑制子抑制胚性愈伤组织的形成 |
| 2.4 讨论 |
| 3 不同红蓝配比的光质对棉花体细胞胚胎发生的影响 |
| 3.1 试验材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 生长条件 |
| 3.1.3 试验设计 |
| 3.1.4 仪器和测量方法 |
| 3.1.5 数据处理 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 不同光质组合影响愈伤的增殖 |
| 3.2.2 不同光质组合对胚性愈伤阶段的影响 |
| 3.2.3 不同光质组合对棉花体细胞胚诱导阶段的影响 |
| 3.2.4 不同光质组合对棉花再生苗诱导阶段的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 4 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文 |
（4）棉花体细胞胚胎发生相关基因GhL1L1的克隆和功能验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 植物的胚胎发育及体细胞胚胎发生 |
| 1.2 激素对体细胞胚胎发生的影响 |
| 1.2.1 生长素 |
| 1.2.2 细胞分裂素 |
| 1.2.3 脱落酸 |
| 1.2.4 乙烯 |
| 1.3 影响体细胞胚胎发生的其他因素 |
| 1.3.1 多胺 |
| 1.3.2 硫氧还蛋白 |
| 1.3.3 表观调控 |
| 1.4 棉花体细胞胚胎发生的研究进展 |
| 1.5 LEC基因的研究进展 |
| 1.5.1 LEC基因的概述 |
| 1.5.2 LEC基因参与表观调控影响植物的生长发育 |
| 1.5.3 LEC基因调控胚胎发生 |
| 1.5.4 LEC基因调控种子中脂肪酸的合成 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 载体和菌株 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 陆地棉GhL1L1的分离和克隆 |
| 2.2.2 陆地棉GhL1L1进化分析 |
| 2.2.3 载体的构建及转基因 |
| 2.2.4 DNA的提取和Southern杂交 |
| 2.2.5 RNA的提取，Northern杂交和q RT-PCR表达分析 |
| 2.2.6 愈伤增殖率（CPR）和胚性愈伤的分化率（EDR）的统计 |
| 2.2.7 内源生长素含量测定 |
| 2.2.8 脂肪酸含量的测定 |
| 2.2.9 GUS定性和定量检测 |
| 2.2.10 组织化学观察 |
| 2.2.11 酵母单杂交（Y1H）点对点验证 |
| 2.2.12 原生质体的分离和双荧光素酶报告基因检测系统实验 |
| 2.2.13 酵母双杂交（Y2H） |
| 2.2.14 Pull-down体外验证蛋白质相互作用 |
| 2.2.15 免疫沉淀质谱分析（IP-MS）鉴定互作蛋白 |
| 2.2.16 双分子荧光互补实验和蛋白共定位及亚细胞定位实验 |
| 2.2.17 Co-IP（Co-Immunoprecipitation）体内验证蛋白质相互作用 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 陆地棉GhL1L1家族分析 |
| 3.1.1 陆地棉GhL1L1进化分析 |
| 3.1.2 GhL1L1的表达分析 |
| 3.1.3 陆地棉GhL1L1超量表达载体和干涉表达载体转化棉花 |
| 3.2 GhL1L1调控棉花的体细胞胚胎发生 |
| 3.2.1 超表达GhL1L1抑制体细胞胚胎发生过程中愈伤组织的增殖 |
| 3.2.2 GhL1L1影响胚性愈伤组织的产生 |
| 3.2.3 GhL1L1影响棉花体细胞胚胎发生过程中生长素的积累和分布 |
| 3.2.4 酵母单杂交和LUC检测系统实验验证GhL1L1调控Gh PP2AA2的表达 |
| 3.2.5 体外和体内实验验证Gh PP2AA2蛋白与Gh PIN1蛋白的相互作用 |
| 3.2.6 生长素运输抑制剂TIBA促进体细胞胚胎发生进程 |
| 3.3 GhL1L1调控棉花脂肪酸合成 |
| 3.3.1 GhL1L1转基因棉花脂肪酸含量的测定 |
| 3.3.2 酵母双杂交和IP-MS筛选GhL1L1的互作蛋白 |
| 3.3.3 体内和体外实验验证GhL1L1与NF-YC蛋白的相互作用 |
| 4 讨论 |
| 4.1 体细胞胚胎发生伴随着复杂的生长素动态变化 |
| 4.2 GhL1L1在陆地棉中的同源基因和进化分析 |
| 4.3 GhL1L1与生长素的极性分布 |
| 4.4 GhL1L1与脂肪酸的合成 |
| 4.5 GhL1L1在胚胎发育过程中存在复杂的调控关系 |
| 参考文献 |
| 附录1 实验中所用到的引物序列 |
| 附录2 NF-YB亚家族基因的FPKM值 |
| 附录3 GhL1L1基因的启动子启动子序列元件预测 |
| 攻读学位期间已发表和待发表论文 |
| 致谢 |
（5）陆地棉体细胞胚胎发生过程中miRNAs及其靶标的鉴定和GhmiR157a/GhSPL10功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物体细胞再生研究进展 |
| 1.1.1 植物体细胞再生简介 |
| 1.1.2 植物再生的分子机制 |
| 1.1.3 棉花体细胞胚胎发生研究进展 |
| 1.2 植物microRNAs的研究进展 |
| 1.2.1 植物miRNAs的动态合成 |
| 1.2.2 植物miRNAs的调控机理 |
| 1.2.3 MIR基因的进化 |
| 1.2.4 植物miRNAs的生物学功能 |
| 1.2.5 植物小RNA及其靶标的研究方法 |
| 1.3 miR156及其靶标基因功能研究进展 |
| 1.3.1 miR156/SPLs调控发育转换和开花 |
| 1.3.2 miR156/SPLs调控生殖器官和果实发育，以及谷物产量 |
| 1.3.3 miR156/SPLs调控叶片异质性 |
| 1.3.4 miR156/SPLs调控表皮毛和侧根发生 |
| 1.3.5 miR156/SPLs参与调控次级代谢物的生物合成和逆境响应 |
| 1.3.6 miR156/SPLs参与植物再生调控 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 棉花体细胞胚胎发生相关miRNAs及靶标的鉴定与分析 |
| 2.1 实验材料和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 实验结果与分析 |
| 2.2.1 小RNA的注释与序列特性分析 |
| 2.2.2 保守和新miRNAs的鉴定 |
| 2.2.3 miRNAs在棉花体细胞胚胎发生过程中的表达模式分析 |
| 2.2.4 miRNA靶标的鉴定 |
| 2.2.5 tas3-siRNAs及其靶标的鉴定 |
| 2.2.6 小RNA靶标的 5’ RACE验证 |
| 2.2.7 靶标的表达模式分析 |
| 2.2.8 靶标与对应miRNAs的表达模式负相关性分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 GhmiR157a/GhSPL10在棉花体细胞胚胎发生中的功能分析 |
| 3.1 实验材料和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 实验结果与分析 |
| 3.2.1 靶标SPLs的进化树和保守结构域分析 |
| 3.2.2 Ghmi R157a和靶标GhSPL10在棉花体细胞胚胎发生过程中的表达模式分析 |
| 3.2.3 Ghmi R157a和GhSPL10超表达影响幼苗生长、愈伤增殖和胚性再分化..59 |
| 3.2.4 RNA seqencing分析GhSPL10超表达系中差异表达基因涉及的信号路径的变化 |
| 3.2.5 类黄酮的过量积累部分解释了GhSPL10超表达系中幼苗表型和愈伤增殖表型 |
| 3.2.6 乙烯信号的增强部分造成GhSPL10超表达系中类黄酮的过量积累 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 GhSPL10超表达导致多个非靶标SPLs的协同上调表达 |
| 3.3.2 类黄酮积累影响愈伤增殖，并且可能是导致GhSPL10超表达系胚性再分化提前的原因 |
| 3.3.3 乙烯信号路径对愈伤起始和增殖起到决定性的作用 |
| 3.3.4 GhSPL10超表达系中乙烯介导的类黄酮生物合成的增加是造成愈伤增殖变快的主要原因 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 已知miRNAs前体信息。 |
| 附录2 预测的已知miRNAs前体结构。 |
| 附录3 预测的新miRNAs前体结构。 |
| 附录4 通过降解组测序鉴定的CK中可能的miRNAs靶标。 |
| 附录5 通过降解组测序鉴定的EC中可能的miRNAs靶标。 |
| 附录6 本研究所用引物。 |
| 附录7 在读期间研究成果 |
| 致谢 |
（6）海岛棉体细胞胚胎同步化发生的研究及GbAIL5、GbAGL15基因的克隆（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 植物体细胞胚胎发生 |
| 1.2 体细胞胚胎的同步化发生 |
| 1.3 体细胞胚胎发生的相关基因 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 第2章 不同处理诱导新海16号体细胞胚胎同步化发生 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 海岛棉GbAIL5 基因编码区的克隆与表达分析 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 海岛棉GbAGL15 基因编码区的克隆与表达分析 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.3 结果分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）GbWOX9基因植物表达载体的构建及对海岛棉胚性细胞的遗传转化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 组织培养概述 |
| 1.2 WOX/WUS基因家族研究进展 |
| 1.3 研究内容及意义 |
| 第2章 海岛棉WOX9 基因的克隆及表达模式分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 GbWOX9 植物表达载体的构建及对胚性细胞的侵染 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 诱导GbWOX9 基因在转化细胞中的过量、抑制表达 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 正、反义GbWOX9 基因的表达模式结果分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 全文结论 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 研究展望及不足 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1 RNA的提取步骤 |
| 2 胶回收步骤 |
| 3 母液的配置 |
| 4 其它培养基的配方 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）棉花（Gossypium hirsutum L.）体细胞胚胎发生的生理及分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 体细胞胚胎发生 |
| 1.2 激素与体细胞胚胎发生 |
| 1.3 胁迫与体细胞胚胎发生 |
| 1.4 体细胞胚胎发生过程中的基因表达 |
| 1.4.1 Somatic embryogenesis receptor kinase(SERK)与体细胞胚胎发生 |
| 1.4.2 Leafy cotyledon (LEC)与体细胞胚胎发生 |
| 1.4.3 Wuschel (WUS)与体细胞胚胎发生 |
| 1.4.4 Germin- like protein encoding genes (GLPs)与体细胞胚胎发生 |
| 1.5 体细胞胚胎发生中的表观修饰 |
| 1.5.1 DNA甲基化 |
| 1.5.2 染色质重组 |
| 1.5.3 Micro RNA |
| 1.6 多胺及其与体细胞胚胎发生的关系 |
| 1.7 转录组学在植物相关领域研究进展 |
| 1.8 蛋白组学在植物相关领域研究进展 |
| 1.9 棉花体细胞胚胎发生相关研究进展 |
| 第二章 棉花(G. hirsutum L.)体细胞胚胎发生De novo转录组研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 植物材料及培养条件 |
| 2.1.2 RNA提取、文库构建以及RNA测序 |
| 2.1.3 测序数据分析以及差异表达基因的鉴定 |
| 2.1.4 液体悬浮系的建立以获得均一化的胚性愈伤组织 |
| 2.1.5 外源IAA、K T、多胺、H2O2以及胁迫处理 |
| 2.1.6 HPLC法测定棉花组织多胺 |
| 2.1.7 DAB染色法测定组织过氧化氢 |
| 2.1.8 ELISA法测定内源激素 |
| 2.1.9 RNA提取及实时荧光定量PCR |
| 2.1.10 统计分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 RNA测序及转录组de novo组装 |
| 2.2.2 基因鉴定及功能注释 |
| 2.2.3 棉花体细胞胚胎发生过程中差异表达基因的比较分析 |
| 2.2.4 差异表达基因KEGG分析 |
| 2.2.5 棉花体细胞胚胎发生过程中的光合作用和碳同化 |
| 2.2.6 棉花体细胞胚胎发生过程中的转录因子 |
| 2.2.7 生长素和细胞分裂素在胚性愈伤组织分化及胚状体形成过程中的作用 |
| 2.2.8 多胺促进棉花体细胞胚胎发生 |
| 2.2.9 活性氧(ROS)能够调控棉花体细胞胚胎发生 |
| 2.2.10 胁迫可以诱导棉花体细胞胚胎发生 |
| 2.2.11 棉花体细胞胚胎发生过程中脂肪酸合成与代谢 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 转录因子调控棉花体细胞胚胎发生 |
| 2.3.2 生长素、细胞分裂素是调控棉花体细胞胚胎发生的重要因素 |
| 2.3.3 多胺和体细胞胚胎发生的关系 |
| 2.3.4 其他激素在棉花体细胞胚胎发生中可能的作用 |
| 第三章 基于i TRAQ的棉花体细胞胚胎发生过程比较蛋白组学研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 新陆早33号的组织培养及体细胞胚胎发生 |
| 3.1.2 蛋白质提取 |
| 3.1.3 蛋白质浓度测量 |
| 3.1.4 SDS电泳 |
| 3.1.5 蛋白质酶解 |
| 3.1.6 i TRAQ标记 |
| 3.1.7 SCX分离 |
| 3.1.8 基于QE的液质联用分析 |
| 3.1.9 蛋白测序数据分析 |
| 3.1.10 生物信息学分析 |
| 3.1.11 RNA提取及实时荧光定量PCR |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 新陆早33号体细胞胚胎发生 |
| 3.2.2 原始数据分析及蛋白鉴定 |
| 3.2.3 蛋白测序样品组内重复性检测 |
| 3.2.4 差异表达蛋白的功能聚类 |
| 3.2.5 差异表达蛋白的统计 |
| 3.2.6 差异表达蛋白的KEGG通路注释 |
| 3.2.7 差异表达蛋白的转录水平分析 |
| 3.2.8 差异表达蛋白的聚类分析 |
| 3.2.9 参与植物激素信号转导相关差异蛋白 |
| 3.2.10 棉花体细胞胚胎发生过程中遗传信息相关蛋白 |
| 3.2.11 次生代谢产物相关蛋白广泛地参与了棉花体细胞胚胎发生 |
| 3.2.12 棉花体细胞胚胎发生过程中糖酵解和糖异生作用 |
| 3.2.13 棉花体细胞胚胎发生过程的脂肪酸合成和代谢 |
| 3.2.14 棉花体细胞胚胎发生中的半乳糖代谢 |
| 3.2.15 棉花体细胞胚胎发生过程转录组、蛋白组关联分析及差异表达相关性 |
| 第四章 棉花组织多胺HPLC测定方法的建立及其在体细胞胚胎发生过程中的变化规律 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 试剂与仪器 |
| 4.1.3 试验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 多胺标准品HPLC测定 |
| 4.2.2 棉花组织培养物多胺HPLC测定方法的优化 |
| 4.2.3 棉花组织培养物HPLC测定 |
| 4.2.4 回收率测定 |
| 4.2.5 棉花体细胞胚胎发生不同时期多胺含量的变化 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 多胺调控棉花体细胞胚胎发生的生理及分子机制研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 新陆早33号棉花的组织培养及体细胞胚胎发生 |
| 5.1.2 液体悬浮系的建立以获得均一化的胚性愈伤组织 |
| 5.1.3 外源物质处理 |
| 5.1.4 HPLC法测定棉花组织多胺 |
| 5.1.5 过氧化氢和一氧化氮的测定 |
| 5.1.6 DAB染色法测定组织过氧化氢 |
| 5.1.7 多胺氧化酶活性测定 |
| 5.1.8 相关基因的描述及认定 |
| 5.1.9 RNA提取及实时荧光定量PCR |
| 5.1.10 统计分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 内源多胺在胚性愈伤组织和胚状体形成初期显着增加 |
| 5.2.2 外源多胺能够促进棉花胚性愈伤组织向胚状体的转化 |
| 5.2.3 H_2O_2和NO在棉花胚性愈伤组织向胚状体转化过程中的作用 |
| 5.2.4 H_2O_2缓解多胺合成抑制剂D-arg的效果促进了胚性愈伤组织向胚状体的转化 |
| 5.2.5 多胺氧化酶在棉花胚性愈伤组织向胚状体转化时起到很重要的正向调控作用 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 全文结论与创新点 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 特色与创新点 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附表 |
（9）茉莉酸促进棉花球形胚表皮细胞发育成体细胞胚的机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 植物体细胞胚胎发生的研究进展 |
| 1.2 植物体细胞胚胎发生的关键基因 |
| 1.2.1 SERK 基因 |
| 1.2.2 WUSCHEL(WUS)基因 |
| 1.2.3 LEAFY COTYLEDON（LEC）基因 |
| 1.2.4 AGAMOUS-Like15（AGL15）基因 |
| 1.2.5 BABY BOOM（BBM）基因 |
| 1.3 植物体细胞胚胎发生的影响因素 |
| 1.4 体细胞胚胎发生的转基因技术手段 |
| 1.5 棉花体细胞胚胎发生的研究进展 |
| 1.6 茉莉酸及AOS与体细胞胚胎发生 |
| 1.7 本课题研究的目的及意义 |
| 第二章 茉莉酸促进次生体细胞胚产生的组织学观察 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 培养基与常用溶液配方 |
| 2.1.4 材料处理 |
| 2.1.5 体视显微镜观察 |
| 2.1.6 扫描电镜观察 |
| 2.1.7 石蜡切片制作并观察 |
| 2.2 实验结果与分析 |
| 2.2.1 体视显微镜观察 |
| 2.2.2 JA最佳浓度确定 |
| 2.2.3 扫描电镜观察 |
| 2.2.4 石蜡切片观察 |
| 2.2.5 组织培养次生胚 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 陆地棉AOS家族基因的生物信息学分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 陆地棉AOS基因家族成员鉴定及进化分析 |
| 3.1.4 染色体定位和亚细胞定位 |
| 3.1.5 启动子序列分析 |
| 3.1.6 RNA提取、反转录及荧光定量 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 陆地棉体细胞胚发育过程中的AOS基因家族成员的鉴定 |
| 3.2.2 陆地棉AOS与其他物种AOS的进化分析 |
| 3.2.3 AOS基因结构及染色体定位和亚细胞定位分析 |
| 3.2.4 启动子的顺式作用元件及功能预测 |
| 3.2.5 陆地棉AOS基因家族表达模式分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 陆地棉AOS家族基因的克隆、载体构建及功能验证 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 载体与菌株 |
| 4.1.3 酶等其他试剂及耗材 |
| 4.1.4 引物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 植物材料 |
| 4.2.2 总RNA的提取及反转录 |
| 4.2.3 Gh AOS1、Gh AOS2和Gh AOS6的克隆 |
| 4.2.4 植物表达载体的构建 |
| 4.2.5 农杆菌感受态的制备及转化 |
| 4.2.6 农杆菌侵染法转化棉花 |
| 4.2.7 转基因棉花阳性材料的鉴定 |
| 4.2.8 转基因阳性材料AOS基因表达水平的检测 |
| 4.2.9 VIGS干涉载体的构建及注射 |
| 4.2.10 VIGS体系中AOS基因干涉水平的检测 |
| 4.2.11 统计过表达或干涉Gh AOS基因对次生胚产生的影响 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 植物过表达载体的构建及农杆菌转化 |
| 4.3.2 转基因材料分子检测 |
| 4.3.3 转基因阳性材料Gh AOS1，Gh AOS2和Gh AOS6基因的表达 |
| 4.3.4 VIGS载体的构建及农杆菌转化 |
| 4.3.5 VIGS结果 |
| 4.3.6 VIGS干涉Gh AOS1，Gh AOS2和Gh AOS6基因的表达 |
| 4.3.7 过表达与VIGS干涉结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 茉莉酸促进次生胚产生的转录组分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料处理 |
| 5.1.2 RNA的提取与检测 |
| 5.1.3 转录组测序 |
| 5.1.4 转录组测序分析 |
| 5.1.5 q RT-PCR定量验证 |
| 5.1.6 体胚中Marker基因q RT-PCR定量验证 |
| 5.2 结果分析 |
| 5.2.1 样品RNA质量检测 |
| 5.2.2 转录组测序与分析 |
| 5.2.3 差异基因分析 |
| 5.2.4 差异基因GO聚类分析 |
| 5.2.5 JA促进次生体细胞胚产生的分子机制的分析 |
| 5.2.6 转录组数据的q RT-PCR验证 |
| 5.2.7 体胚Marker基因的q RT-PCR验证 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 创新点、结论及展望 |
| 6.1 全文结论 |
| 6.2 展望 |
| 6.3 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）陆地棉体细胞胚胎发生关键基因挖掘及机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 植物体细胞胚胎发生研究进展 |
| 1.1.1 细胞全能性与体细胞胚胎发生的概念 |
| 1.1.2 植物体外再生的途径 |
| 1.1.3 体细胞胚胎发生的影响因素 |
| 1.1.4 体细胞胚胎发生的转基因技术手段 |
| 1.1.5 体细胞胚胎发生的研究进展 |
| 1.1.6 棉花体细胞胚胎发生的技术瓶颈 |
| 1.2 控制体细胞胚胎发生的关键基因 |
| 1.2.1 蛋白激酶类基因 |
| 1.2.2 转录因子类基因 |
| 1.2.3 生长素信号通路类基因 |
| 1.2.4 细胞分裂素信号通路类基因 |
| 1.3 研究的目的意义和内容 |
| 1.3.1 研究的目的意义 |
| 1.3.2 研究内容 |
| 第二章 陆地棉 GhSERK1、GhMAPK16 和 AtWuschel 克隆 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株和质粒 |
| 2.1.3 生物药品及试剂 |
| 2.2 实验方法和步骤 |
| 2.2.1 棉花组织培养 |
| 2.2.2 植物 RNA 提取及反转录 |
| 2.2.3 电子克隆 GhSERK1 和 GhMAPK16 及 AtWuschel 的 CDS 序列 |
| 2.2.4 GhSERK1 和 GhMAPK16 及 AtWuschel 的 CDS 区扩增 |
| 2.2.5 目的片段回收 |
| 2.2.6 T 载体连接及测序 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 RNA 提取及质量检测 |
| 2.3.2 电子克隆 |
| 2.3.3 PCR 扩增结果 |
| 2.3.4 T 载体连接与检测 |
| 2.3.5 测序结果 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 GhSERK1 和 GhMAPK16 生物信息学分析 |
| 3.1 分析方法 |
| 3.1.1 预测蛋白理化性质和氨基酸组份 |
| 3.1.2 蛋白系统进化树构建 |
| 3.1.3 蛋白功能结构域分析 |
| 3.2 结果分析 |
| 3.2.1 预测蛋白的基本性质 |
| 3.2.2 同源蛋白的进化关系 |
| 3.2.3 预测蛋白保守域特点 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 GhSERK1、GhMAPK16 和 AtWuschel 的功能验证 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 菌株和质粒 |
| 4.1.3 生物试剂 |
| 4.2 方法步骤 |
| 4.2.1 转基因材料准备 |
| 4.2.2 过表达载体的构建 |
| 4.2.3 农杆菌 LBA4404 感受态的制备 |
| 4.2.4 质粒转化农杆菌 |
| 4.2.5 农杆菌介导的遗传转化棉花和继代培养 |
| 4.2.6 植物 DNA 的提取 |
| 4.2.7 植物 RNA 提取及反转录 |
| 4.2.8 目的基因在棉花中的表达模式 |
| 4.2.9 目的基因在转基因材料中的表达情况 |
| 4.2.10 转基因材料对体细胞胚胎发生过程的影响 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 过表达载体的构建情况 |
| 4.3.2 目的基因的时空表达模式 |
| 4.3.3 转基因材料目的基因的表达情况 |
| 4.3.4 目的基因对体细胞胚胎发生的作用 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 AtWuschel 促进体细胞胚胎发生的分子机制研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 方法步骤 |
| 5.2.1 不同棉花品种的组织培养和分化率统计 |
| 5.2.2 植物 RNA 提取和反转录 |
| 5.2.3 AtWuschel 可能下游基因的筛选 |
| 5.2.4 实时定量引物的合成与筛选 |
| 5.2.5 实时定量实验及分析 |
| 5.2.6 RNA 干涉载体的构建及遗传转化 |
| 5.2.7 扫描电镜观察 |
| 5.3 结果分析 |
| 5.3.1 不同棉花品种的愈伤组织分化率 |
| 5.3.2 实时定量引物的选择 |
| 5.3.3 AtWuschel 对细胞分裂素信号通路的影响 |
| 5.3.4 AtWuschel 对生长素信号通路的影响 |
| 5.3.5 AtWuschel 正调控 GhLEC1、GhLEC2 和 GhFUS348 |
| 5.3.6 AtWuschel 过表达对胚状体发育的影响 |
| 5.3.7 GhLEC1、GhLEC2 和 GhFUS3 对胚性愈伤组织诱导的影响 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 陆地棉 CRI24 全长 cDNA 均一化质粒穿梭文库的构建 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 方法和步骤 |
| 6.2.1 植物总 RNA 的提取 |
| 6.2.2 mRNA 的分离 |
| 6.2.3 全长 cDNA 文库的构建 |
| 6.2.4 文库质量鉴定 |
| 6.2.5 均一化文库构建 |
| 6.2.6 目的载体的文库构建 |
| 6.2.7 目的载体 cDNA 文库质量鉴定 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 RNA 质量鉴定结果 |
| 6.3.2 全长文库鉴定结果 |
| 6.3.3 均一化文库鉴定结果 |
| 6.3.4 目的载体文库鉴定结果 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 全文结论、创新点及研究展望 |
| 7.1 全文结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、Differential Expression of Genes during Somatic Embryogenesis in Upland Cotton（论文参考文献）
- [1]陆地棉BABY BOOM基因的克隆及特征分析[J]. 束立哲,宫则宇,雷忠萍,唐保善,卢碧霞,宋银,贺道华. 农业生物技术学报, 2021(05)
- [2]棉花响应烟粉虱胁迫的分子机制及棉花体细胞胚胎表观基因组学研究[D]. 李健英. 华中农业大学, 2019
- [3]GhWOX11/12基因和红蓝光质对棉花体细胞胚胎发生的影响[D]. 魏喜. 沈阳农业大学, 2019(03)
- [4]棉花体细胞胚胎发生相关基因GhL1L1的克隆和功能验证[D]. 徐娇. 华中农业大学, 2018(01)
- [5]陆地棉体细胞胚胎发生过程中miRNAs及其靶标的鉴定和GhmiR157a/GhSPL10功能分析[D]. 王丽晨. 华中农业大学, 2017(01)
- [6]海岛棉体细胞胚胎同步化发生的研究及GbAIL5、GbAGL15基因的克隆[D]. 郭家雁. 新疆农业大学, 2017(02)
- [7]GbWOX9基因植物表达载体的构建及对海岛棉胚性细胞的遗传转化[D]. 李娟. 新疆农业大学, 2017(02)
- [8]棉花（Gossypium hirsutum L.）体细胞胚胎发生的生理及分子机制研究[D]. 程文翰. 石河子大学, 2016(02)
- [9]茉莉酸促进棉花球形胚表皮细胞发育成体细胞胚的机理研究[D]. 吴洁. 中国农业科学院, 2016(02)
- [10]陆地棉体细胞胚胎发生关键基因挖掘及机理研究[D]. 郑武. 中国农业科学院, 2014(10)