一、卵泡闭锁与颗粒细胞凋亡（论文文献综述）
赵云[1]（2021）在《视黄醇结合蛋白4对猪卵泡颗粒细胞功能的影响及其机制研究》文中进行了进一步梳理卵泡发育不但受“下丘脑-垂体-卵巢轴”分泌的激素调节,而且受旁分泌和自分泌因子调控。卵泡颗粒细胞是卵泡内体细胞的主要类型,主要功能为合成分泌激素和细胞因子,为卵母细胞成熟和卵泡发育提供营养物质。颗粒细胞分泌的细胞因子通过复杂的信号转导,参与优势卵泡选择和卵泡闭锁的调控。研究证实,颗粒细胞凋亡是卵泡闭锁的潜在机制。因此,阐明颗粒细胞凋亡机制,为提高雌性动物繁殖能力和治疗卵巢疾病具有重要的科学意义。视黄醇结合蛋白4（RBP4）属于载脂蛋白家族成员之一,是视黄醇的特异性转运蛋白,负责将视黄醇从肝脏转运至外周组织。研究表明,RBP4在许多哺乳动物卵巢中表达,血液中RBP4含量与人的胰岛素抵抗和多囊卵巢综合症相关,猪囊肿卵泡液中有高浓度的RBP4蛋白,推测RBP4可能参与调控颗粒细胞功能。但目前有关RBP4对卵泡颗粒细胞的调控研究相对较少。为了探讨RBP4的功能,通过构建RBP4过表达载体包装慢病毒和设计干扰RNA,改变猪卵泡颗粒细胞RBP4的表达量,采用流式细胞术、RT-qPCR和Western blotting等分子生物学技术,从基因和蛋白表达水平检测RBP4对猪卵泡颗粒细胞凋亡和孕酮合成分泌的影响。通过高通量测序分析,发现RBP4处理组差异表达基因富集在胰岛素通路中,结合胰岛素下游通路ERK1/2位点的抑制剂（U0126）处理,阐明RBP4通过ERK1/2信号通路影响颗粒细胞凋亡和孕酮分泌的分子机制。本研究主要结果如下:1.构建猪RBP4基因慢病毒表达载体并成功包装pLVX-RBP4重组慢病毒,病毒滴度达到3×108TU/m L;重组慢病毒成功感染原代培养的猪卵泡颗粒细胞,并且细胞中RBP4基因的表达水平显着升高。过表达RBP4能显着降低BCL2和XIAP的表达水平,增加BAX的表达量,促进猪卵泡颗粒细胞凋亡,抑制孕酮分泌。2.设计合成RBP4干扰序列,确定siRBP4＿01干扰片段转染颗粒细胞72 h,能显着降低RBP4的表达水平。干扰RBP4能增加细胞活力,显着降低CASPASE和BAX表达量,抑制颗粒细胞凋亡。3.使用慢病毒处理猪卵泡颗粒细胞72 h,利用高通量测序检测mRNA表达图谱的变化。结果显示,与对照组相比,检测到113个差异基因,71个基因上调,42个基因下调;差异基因主要富集在氧化磷酸化通路、胰岛素通路、AMPK等16个信号通路。4.干扰RBP4能激活ERK1/2通路,siRBP4＿01能减弱U0126对ERK1/2通路的抑制作用,siRBP4＿01组与siRBP4＿01+U0126组相比,细胞活力增加,凋亡基因的表达量显着下降,抑制颗粒细胞凋亡。因此,RBP4主要通过抑制ERK1/2通路激活,调控颗粒细胞凋亡,抑制孕酮合成分泌。综上所述,本研究通过慢病毒过表达和干扰RNA处理猪卵泡颗粒细胞,利用RT-qPCR、Western blotting以及分子网络分析等研究手段,证明了RBP4可通过抑制ERK1/2信号通路,促进颗粒细胞凋亡基因的表达,降低颗粒细胞活力,促进颗粒细胞凋亡;同时,抑制颗粒细胞中孕酮合成基因的表达,降低孕酮分泌。本研究的结果为RBP4在卵泡发育及颗粒细胞发育过程中所涉及的调控机制提供了新的见解。
余庆[2]（2021）在《Wnt/β-Catenin信号通路的激活或抑制对水牛颗粒细胞雌二醇和孕酮合成的影响》文中指出研究表明,Wnt/β-Catenin信号通路与颗粒细胞雌二醇和孕酮的合成调控有关。为此,本研究拟探索Wnt/β-Catenin信号通路影响水牛卵泡颗粒细胞雌二醇和孕酮合成的作用与机制,以了解Wnt/β-Catenin信号通路在水牛卵泡发育中的调控作用。1.对比了颗粒细胞在有血清和无血清培养下FSHR的表达和细胞生长情况,以及来自不同大小卵泡的颗粒细胞中Wnt3a的蛋白表达。结果显示,无血清培养除细胞贴壁率低于有血清培养外,不影响FSHR在颗粒细胞中的表达;无血清培养条件下颗粒细胞生长曲线和血清培养变化趋势基本一致,生长曲线都基本为“S”形;Wnt3a在不同大小卵泡的颗粒细胞中都有表达,且在大卵泡要显着高于中、小卵泡（P<0.05）。2.探讨了Wnt/β-Catenin信号通路激活剂Wnt3a对颗粒细胞雌二醇和孕酮合成的影响及其分子机制。首先,使用不同浓度（0、50、100、150 ng/ml）Wnt3a无血清培养基处理颗粒细胞48h,通过MTT、ELISA、RT-q PCR、Western Blot分别检测了颗粒细胞活力、雌二醇和孕酮的分泌量、雌二醇和孕酮合成关键酶基因m RNA和蛋白的表达。结果显示,与对照组（0 ng/ml Wnt3a）相比,Wnt3a浓度为50和100 ng/ml时颗粒细胞活力没有明显改变,当浓度为150 ng/ml时颗粒细胞活力显着降低（P<0.05）;50 ng/ml Wnt3a组雌二醇含量下降不明显（P>0.05）,100和150 ng/ml组Wnt3a显着降低了颗粒细胞雌二醇的分泌（P<0.05）;50、100、150 ng/ml Wnt3a组孕酮浓度都显着上调（P<0.05）,且各组间差异显着（P<0.05）;100和150 ng/ml组Wnt3a能够显着下调雌二醇合成关键酶基因CYP19A1和HSD17B1的m RNA表达水平（P<0.05）,能够显着上调孕酮合成关键酶基因St AR和HSD3B1的m RNA表达水平（P<0.05）;50、100、150 ng/ml组Wnt3a能够显着下调颗粒细胞雌二醇合成关键酶CYP19A1和HSD17B1的蛋白表达（P<0.05）,并且均能够显着上调颗粒细胞孕酮合成关键酶St AR和HSD3B1的蛋白表达（P<0.05）。其次,通过流式细胞术和Western Blot比较了对照组（0 ng/ml Wnt3a）和Wnt3a处理组（100 ng/ml Wnt3a）颗粒细胞凋亡、凋亡以及Wnt/β-Catenin信号通路相关蛋白的表达。结果表明,Wnt3a能够促进颗粒细胞凋亡,上调了Bax的表达而下调了Bcl2的表达（P<0.05）;Wnt3a有效激活了Wnt/β-Catenin信号通路,并且促进了内源性Wnt3a和Foxo3a的蛋白表达（P<0.05）。3.探讨了Wnt/β-Catenin信号通路抑制剂XAV939对颗粒细胞雌二醇和孕酮合成的影响及其作用机制。首先,颗粒细胞经不同浓度（0、2.5、5、10μM）XAV939无血清培养基培养48h,通过MTT、ELISA、RT-q PCR、Western Blot分别检测了颗粒细胞增殖、雌二醇和孕酮的分泌、雌二醇和孕酮合成关键酶基因和蛋白的表达。结果发现,与对照组（0μM XAV939）相比,不同浓度XAV939对颗粒细胞增殖没有显着影响（P>0.05）;2.5μM XAV939组雌二醇浓度差异不显着（P>0.05）,5μM和10μM XAV939组雌二醇浓度显着升高（P<0.05）,且10μM XAV939组显着高于5μM组（P<0.05）;5和10μM XAV939组孕酮浓度显着降低（P<0.05）,2.5μM组与对照组、5μM组差异均不显着（P>0.05）,10μM组孕酮浓度最低,显着低于对照组、2.5μM组和5μM组（P<0.05）;5μM和10μM组XAV939显着上调雌二醇合成关键酶基因CYP19A1和HSD17B1的m RNA表达（P<0.05）,显着下调孕酮合成关键酶基因St AR和HSD3B1的m RNA表达（P<0.05）;5和10μM XAV939能够显着上调颗粒细胞中雌二醇合成关键酶CYP19A1和HSD17B1的蛋白表达（P<0.05）,10μM XAV939显着下调颗粒细胞孕酮合成关键酶St AR和HSD3B1的蛋白表达量（P<0.05）。其次,通过流式细胞术、Western Blot检测了对照（0μM XAV939）组和XAV939（10μM XAV939）组颗粒细胞凋亡、凋亡以及Wnt/β-Catenin信号通路相关蛋白的表达。结果显示,XAV939能够抑制颗粒细胞凋亡,下调了Bax的表达而上调了Bcl2的表达（P<0.05）;XAV939能够抑制Wnt/β-Catenin信号通路,并且减弱了Wnt3a和Foxo3a的表达（P<0.05）。综上所述,Wnt/β-Catenin信号通路与水牛卵泡颗粒细胞雌二醇和孕酮的合成相关。Wnt/β-Catenin信号通路激活和抑制分别抑制和促进雌二醇的合成,而促进和抑制孕酮的合成,从而参与水牛卵泡发育的调控。
赵金[3]（2021）在《BMP15通过BMPR1B调控陕北白绒山羊卵泡颗粒细胞功能的分子机制》文中研究指明陕北白绒山羊是利用辽宁绒山羊与陕北黑山羊杂交选育的绒肉兼用型优质绒山羊品种,具有产绒量高、绒质优、耐粗饲和抗逆性强等优点。众所周知,母羊产羔率等繁殖性状作为绒山羊的重要经济性状之一,直接影响了其生产效率和经济效益。因此,研究影响绒山羊母羊产羔率的生物学机制,对提高绒山羊的养殖收益具有重要实践价值,也在山羊繁殖性能调控机制等基础研究中具有重要理论意义。母羊的产羔率是由多基因调控的复杂过程,其中骨形态发生蛋白受体1B（bone morphogenetic protein receptor 1B,BMPR1B）基因作为影响山羊产羔性状的候选基因,在陕北白绒山羊卵泡发育过程中的表达规律,影响BMPR1B基因表达的调控因素,以及BMPR1B调控卵泡发育的生物学机制等方面尚不清楚。本研究以陕北白绒山羊卵巢、卵泡以及卵泡颗粒细胞为研究对象,克隆BMPR1B基因并做生物信息学分析和遗传学分析,应用免疫组织化学技术、实时荧光定量多聚核苷酸链式反应技术、蛋白质印迹技术、5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷掺入技术、酶联免疫吸附剂测定技术、流式细胞术等研究了BMPR1B基因在陕北白绒山羊卵泡发育过程中的表达规律和影响其表达的调控因素;再通过包装慢病毒过表达BMPR1B、sh RNA干扰BMPR1B表达等方法,从颗粒细胞层面揭示了骨形态发生蛋白15（bone morphogenetic protein 15,BMP15）通过受体BMPR1B影响陕北白绒山羊颗粒细胞增殖、凋亡及类固醇激素合成、分泌的分子调控机制。获得的主要研究结果如下:1.克隆陕北白绒山羊BMPR1B基因并进行序列分析。以陕北白绒山羊卵巢总RNA反转录的c DNA为模板,克隆出BMPR1B基因CDS区,测序得到该基因全长1509 bp。蛋白跨膜区分析表明BMPR1B属于跨膜蛋白,包含TGFβ家族I型受体特有的丝氨酸/苏氨酸（Gly/Ser）激酶结构域。2.对BMPR1B基因在陕北白绒山羊生殖系统中的表达模式和特点进行分析。BMPR1B在陕北白绒山羊子宫、卵巢和输卵管中均有表达且存在差异,其中卵巢的相对表达量最高,其次是输卵管,在子宫中表达量最低。BMPR1B在各发育阶段的卵泡和黄体内均有表达,其丰度随着卵泡发育成熟逐渐升高,在黄体内略有下降但仍维持较高的表达水平。BMPR1B在卵泡颗粒细胞和卵母细胞内均有表达,在颗粒细胞中的表达显着高于卵母细胞。BMPR1B基因与产羔数密切相关,在多羔母羊卵巢组织中的表达量显着高于单羔母羊。3.从细胞水平分析了BMP15对BMPR1B的调控作用。通过向体外培养的陕北白绒山羊卵泡颗粒细胞添加外源BMP15,证实BMP15可调控其I型受体BMPR1B和II型受体BMPR2的表达,并通过抑制BMPR1B基因的负调控mi RNA,mi R-125b的表达来上调BMPR1B基因的表达水平。4.研究证明BMP15通过受体BMPR1B激活MAPK通路调控山羊卵泡颗粒细胞增殖和凋亡。BMP15通过BMPR1B使得下游MAPK信号通路中ERKs磷酸化水平升高,激活MAPK ERK信号通路,上调细胞周期蛋白Cyclin E和周期蛋白依赖性激酶CDK2的表达,增加处于细胞周期S期细胞的比例,促进卵泡颗粒细胞的增殖;上调抑凋亡基因Bcl2的表达并下调促凋亡基因Bax和凋亡关键基因Caspase-3的表达,阻断细胞的凋亡途径,抑制颗粒细胞凋亡。5.研究证明BMP15通过受体BMPR1B激活Smad通路调控山羊卵泡颗粒细胞类固醇激素合成及分泌。BMP15通过BMPR1B使得下游Smad信号通路中Smad1/5/8蛋白磷酸化水平和Smad4蛋白表达水平升高,激活Smad信号通路,上调FSHR的表达水平,进而诱导类固醇激素合成相关基因St AR、CYP11A1和CYP19A1的表达,促进卵泡颗粒细胞E2、P4的合成和分泌。综上所述,本研究通过研究体外培养的山羊颗粒细胞,构建了BMP15通过BMPR1B对颗粒细胞增殖、凋亡及类固醇激素分泌的调控网络,揭示了BMP15通过受体BMPR1B调控绒山羊卵泡发育及闭锁的分子机制,为深入研究提高山羊繁殖力提供了新的实验依据,为提高陕北白绒山羊的繁殖性能提供理论和技术指导。
侯晗琦[4]（2021）在《MiR-99a调控猪颗粒细胞增殖凋亡的作用机制研究》文中研究指明MicroRNA（miRNA）是一类长度在19-25 nt之间的短链非编码RNA,广泛存在于动物的各种组织细胞,通过调控转录和翻译参与动物的生理与病理过程调控。miR-99a是一种在癌症组织低表达而在卵巢组织高表达的miRNA,与卵泡闭锁过程中的颗粒细胞凋亡有关,但在猪卵泡发育过程中的调控作用研究较少。为此,本研究检测了miR-99a在不同闭锁程度猪卵泡中的表达情况,并对其影响猪颗粒细胞增殖和凋亡的作用与机制进行了研究。结果发现,早期闭锁卵泡中的miR-99a表达水平高于健康卵泡和晚期闭锁卵泡。在HEK-293T细胞中采用双荧光素酶报告实验验证了m TOR是miR-99a直接的靶基因。传代培养三代的猪颗粒细胞转染50 n M的miR-99a的Mimics 48小时后,细胞增殖受到抑制,细胞凋亡水平上升,细胞周期阻滞在S期。与空白对照组相比,细胞周期蛋白基因Cyclin B、Cyclin D的表达显着下调（P<0.05）,细胞周期蛋白依赖性激酶基因CDK1、CDK4的表达极显着上调（P<0.01）,自噬相关基因ATG13和促凋亡基因BAD与BAX的表达显着上调（P<0.05）,抑凋亡基因BCL-2和促凋亡基因TP53的表达变化不显着（P>0.05）。m TOR信号通路中的m TOR基因表达量极显着下调（P<0.01）、AKT及AKT1表达量显着下调（P<0.05）,m TOR蛋白表达水平降低。猪颗粒细胞转染100 n M的miR-99a Inhibitors 48小时后,细胞周期与细胞凋亡无明显变化。与空白对照组相比,CDK1、CDK4、Cyclin D、Cyclin B、BAD、BCL-2、TP53、ATG13、AKT和AKT1的表达无显着变化（P>0.05）,BAX的表达显着上调（P<0.05）,m TOR基因表达极显着上调（P<0.01）,但m TOR蛋白表达水平无明显变化。上述结果表明,miR-99a具有抑制猪颗粒细胞增殖和促进猪颗粒细胞凋亡的作用,这一作用可能是通过抑制其靶向基因m TOR表达,进而下调AKT信号通路相关基因表达、上调凋亡相关基因和自噬相关基因表达实现的。
时胜洁[5]（2021）在《miR-184调控猪卵巢颗粒细胞雌二醇合成、增殖和凋亡的作用研究》文中指出提高母猪繁殖性能是我国畜牧业发展的重要研究方向,卵泡的生长发育状态会直接影响卵巢组织的正常生理功能,而颗粒细胞作为卵泡中主要的体细胞,其雌二醇合成、增殖和凋亡会影响卵泡的生长发育和闭锁,因此探究调控颗粒细胞雌二醇合成、增殖和凋亡的影响因素至关重要。Micro RNA（miRNA）是由19-22个核苷酸（nt）组成的非编码RNA,能够与靶基因的3’UTR区互补配对从而抑制靶基因的转录或翻译,近年来很多研究已经表明miRNA对颗粒细胞具有调控作用。在高低产大白猪卵巢组织的测序文章中发现miR-184在高产母猪卵巢组织中的表达量显着高于低产母猪,并采集高低产大白×长白二元杂交母猪的卵巢组织进行试验验证,得到与前人一致的结果,并且miR-184在各物种间是高度保守的。因此,本研究以原代猪卵巢颗粒细胞为试验材料,旨在探究miR-184对猪卵巢颗粒细胞雌二醇合成、增殖和凋亡的调控作用。在本研究中,通过培养猪卵巢颗粒细胞并将miR-184的模拟物（miR-184 agomir）和拮抗剂（miR-184 antagomir）转染进细胞,通过RT-q PCR、Western Blot、ELISA、流式细胞术、Ed U染色、CCK-8、双荧光素酶报告试验等方法探究miR-184对猪卵巢颗粒细胞雌二醇合成、增殖凋亡的调控作用及分子机制。本研究主要获得以下结果:1.miR-184的表达特征分析通过比较miR-184在不同物种间的成熟序列,发现miR-184是高度保守的。检测miR-184在高低产大白×长白母猪卵巢组织的表达,发现其在高产仔数母猪卵巢组织中表达量更高;将miR-184的靶基因进行GO分析及KEGG分析,结果表明,miR-184可能参与到调控颗粒细胞生理功能的过程。2.miR-184通过靶定NR1D1促进颗粒细胞的雌二醇合成过表达miR-184促进颗粒细胞的雌二醇合成,并显着上调雌二醇合成关键基因Star、Cyp11a1、Cyp19a1 m RNA水平的表达;在蛋白水平上,过表达miR-184后,St AR有上调趋势,CYP11A1和CYP19A1明显上调;而干扰miR-184出现相反的结果。在颗粒细胞雌二醇合成过程中,miR-184的种子序列与NR1D1 3’UTR互补配对;过表达miR-184能够降低野生型NR1D1 3’UTR的荧光素酶活性,而对突变型没有影响;过表达miR-184会抑制NR1D1的m RNA及蛋白水平的表达,干扰miR-184得到相反的结果;在过表达miR-184的同时过表达NR1D1,会减弱miR-184对雌二醇合成的促进作用。3.miR-184通过靶定p21促进颗粒细胞的增殖过表达miR-184会促进颗粒细胞的增殖;并上调细胞周期相关基因Cyclin B、Cyclin D、Cyclin E和CDK4 m RNA和蛋白水平的表达;干扰miR-184则起到相反的作用。在颗粒细胞增殖过程中,miR-184的种子序列能够靶定p21 3’UTR区;过表达miR-184能够降低p21 3’UTR野生型荧光素的活性而对突变型没有影响;同时,过表达miR-184能够抑制p21 m RNA和蛋白的表达;而干扰miR-184会明显上调p21的转录和翻译;过表达p21会减弱miR-184对颗粒细胞增殖的促进作用。4.miR-184通过靶定HIPK2抑制颗粒细胞的凋亡过表达miR-184会在m RNA和蛋白水平上调抗凋亡基因BCL-2的表达,下调促凋亡基因BAX的表达;干扰miR-184会得到相反的结果,并且干扰miR-184显着上调早期凋亡和晚期凋亡的细胞比例。在颗粒细胞凋亡过程中,miR-184的种子序列与HIPK2 3’UTR区互补配对;过表达miR-184降低野生型HIPK2 3’UTR的荧光活性而对突变型没有影响;过表达miR-184抑制HIPK2的转录和翻译;干扰miR-184促进其转录和翻译。综上所述,在猪卵巢颗粒细胞中,miR-184通过分别靶定NR1D1、p21及HIPK2从而促进颗粒细胞的雌二醇合成,促进细胞增殖并抑制细胞凋亡。
刘楠楠[6]（2021）在《低温导致四川华鳊卵泡闭锁的机制研究》文中研究说明四川华鳊（Sinibrama taeniatus）是长江上游特有的小型经济鱼类,由于其分布范围狭窄以及人为捕捞和水利设施修建等原因,部分地区的种群已经出现小型化趋势。人工增殖放流是改善鱼类野生资源下降情况的有效手段。目前四川华鳊的人工繁殖已经取得初步成功。饲养时我们发现温度是影响雌鱼成功繁殖的关键因素之一,但目前对于温度,尤其是低温对鱼类繁殖影响的研究还不够深入,四川华鳊这方面的研究更是缺乏。因此本研究采用形态学、组织学和转录组测序等手段,探究了低温对四川华鳊卵巢发育的影响和调控方式,以期为其保护生物学研究和人工繁殖提供理论基础。具体研究结果如下:1.26℃条件下,四川华鳊雌鱼的繁殖周期为14 d。对26℃条件下产卵后四川华鳊进行为期4周的卵巢形态学以及组织学观察。产卵后第0天（IC）其卵巢萎瘪,卵巢内卵母细胞以单层滤泡时相（Ⅱ时相）和卵黄泡出现时相（Ⅲ时相）为主,此时卵巢处于Ⅱ-Ⅲ期状态;在第1周末（W1）,卵粒直径显着增加（P<0.05）,卵巢内卵母细胞以卵黄充满时相（Ⅳ时相）早期和中期为主,卵巢发育到Ⅳ期;在第2周末（W2）,卵巢膨大,卵巢重量和卵粒直径较IC显着增加（P<0.05）,卵巢内卵母细胞以Ⅳ时相晚期为主,卵巢发育到Ⅳ期末,达到可催产状态;在第3周末（W3）,轻压鱼体腹部,有过熟变质的卵子流出,卵巢内卵粒直径略有减小（P<0.05）,组织学观察发现卵巢内有较多Ⅳ时相晚期卵母细胞以及卵子排出后的空滤泡;在第4周末（W4）,卵巢较W3膨大,卵粒直径增加（P<0.05）,卵巢内卵母细胞又恢复到Ⅳ时相晚期为主。以上数据表明四川华鳊在26℃条件下,其繁殖周期约为14 d。后续对100尾四川华鳊雌鱼以14 d为周期进行连续催产,3次催产成功率均>80%。同时对3次催产后的卵子受精率,受精卵孵化率和胚胎畸形率进行统计,发现并无显着差异（P>0.05）。证明该条件下四川华鳊具有稳定的繁殖周期—14 d,且多次催产对卵子和胚胎质量影响不大。2.低温导致四川华鳊卵泡发生闭锁。对产卵后四川华鳊进行11℃的低温饲养,共14 d,与26℃条件下其卵巢发育状况进行对比。形态学和组织学结果显示低温使四川华鳊卵巢发育被抑制,卵母细胞明显发育不良,发生退化,出现滤泡细胞层和卵膜崩解,细胞核消失,卵黄物质被吞噬以及橙褐色色素细胞积累等典型的闭锁卵泡特征。同时卵巢性腺成熟系数（Gonadosomatic inpex,GSI）在W2相较于26℃组显着下降（P<0.05）。3.低温导致四川华鳊卵泡闭锁的调控机制。通过对26℃组和11℃组在W1和W2的差异共表达基因进行KEGG富集分析发现:卵巢类固醇合成和甾体激素生物合成等脂质合成和代谢相关通路被显着富集。对四川华鳊卵巢中相关基因的相对表达水平进行Real-time PCR测定,结果显示卵巢类固醇激素合成及卵母细胞发育成熟相关基因St AR、cyp17a1、hsd3b、cyp19a2、hsd17b1、vtg1、zp4、mmp9和mmp15在11℃组的表达多受到明显抑制（P<0.05）。又对血清激素水平进行检测,发现在11℃组,DHP（17α,20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one）水平在W1和W2极显着低于26℃组（P<0.01）,LH（Luteinizing hormone）水平在W1显着低于26℃组（P<0.05）,FSH（Follicle-stimulating hormone）水平在W2极显着低于26℃组（P<0.01）,而E2（Eestradiol）和11-KT（11-ketone testosterone）水平在两组之间无显着差异（P>0.05）。但对卵巢内相应激素受体基因fshr、lhcgr、pgr、esr1和ar的相对表达水平进行Real-time PCR检测,却发现在11℃组各激素受体基因的表达水平随着时间推移显着下降（P<0.05）,并显着低于26℃组（P<0.05）。由此推测低温之所以导致四川华鳊卵泡发生闭锁,可能是由于抑制了部分促性腺激素和类固醇激素的合成和分泌。但激素水平受到的影响较小,更重要的原因可能是由于激素受体表达降低,使卵母细胞对激素的敏感度降低,激素作用受阻。另外将26℃组和11℃组的基因表达模式与GSI和激素受体基因fshr、lhcgr、pgr、esr1和ar的相对表达水平进行WGCNA（Weighted gene co-expression network analysis）分析,发现除类固醇激素合成相关通路外,细胞生长增殖和凋亡相关通路也被多次显着富集,与低温的影响显着相关。对相关基因的相对表达水平进行Real-time PCR测定,发现细胞生长增殖和抗凋亡相关基因ccni、cdk16、igf1r、egfr、nobox和bcl2的表达水平在11℃组显着下调（P<0.05）,而促凋亡基因bax、tnf、tp53和casp3的表达水平在11℃组多显着上调（P<0.05）。由此可见,在低温导致四川华鳊卵泡闭锁的过程中,细胞凋亡起到重要调控作用。经TUNEL（TDT-mediated d UTP nick-end labeling）凋亡检测发现:低温作用下四川华鳊卵巢滤泡细胞层凋亡加剧。综上所述,本研究推测低温之所以导致四川华鳊卵泡发生闭锁,一方面是由于低温抑制了促性腺激素和类固醇激素的合成和作用;另一方面,低温促使卵泡细胞发生凋亡,从而使四川华鳊卵巢发育和卵母细胞生长增殖受限,发生退化,最终导致卵泡退化闭锁。
杜冰[7]（2021）在《Sohlh1基因敲除小鼠卵泡闭锁异常及其机制的研究》文中认为目的:卵巢是雌性哺乳动物重要的生殖器官,卵泡作为卵巢发育的基本结构与功能的单位,由卵母细胞及围绕在卵母细胞周围的颗粒细胞组成。卵泡发育起始于原始卵泡,在出生前后于卵巢皮质汇聚成原始卵泡池,原始卵泡经募集与激活发育为初级卵泡,初级卵泡再经次级卵泡、有腔卵泡阶段最终发育成熟并排卵,或在卵泡发育过程中走向闭锁。卵泡池中的原始卵泡作为卵巢中的卵泡储备决定了雌性动物生育年龄的长短,卵巢中的卵泡储备主要受初始卵泡数量和卵泡闭锁速度的影响。原始卵泡在形成后其数量便不再增加,决定了雌性动物最初的卵泡数量。卵泡闭锁指卵泡在发育一定阶段后停止发育并发生退化甚至消失的现象,卵巢内绝大多数卵泡都将走向闭锁,仅少数卵泡能够成功发育至成熟排卵。正常的卵泡闭锁可以保证卵巢内卵泡储备缓慢又稳定地减少,维持着卵巢内卵泡储备数量的动态平衡。而卵泡闭锁速度的加快能够使卵巢内的卵泡储备过早耗尽,引起雌性生育年龄的缩短,卵巢功能提前衰竭,发生卵巢早衰（POF）。Sohlh1是卵巢早衰的候选基因之一,其作为生殖相关转录因子,能够特异结合下游基因启动子的E-Box位点（CANNTG）并发挥转录调控作用。在雌性哺乳动物中,Sohlh1只表达于胚胎期的卵原细胞以及出生后的原始卵泡和初级卵泡阶段的卵母细胞内,在早期卵泡的发育过程中发挥重要的作用。Pangas等人通过对Sohlh1（-/-）小鼠的研究发现:Sohlh1的缺失并不影响初始卵泡的数量,但Sohlh1（-/-）鼠中的原始卵泡在出生后几天内迅速减少,导致卵泡储备数量不足,在青春期前便发生卵巢早衰。我们推测卵泡异常闭锁可能是引起敲除小鼠发生卵巢早衰的重要原因,而由Sohlh1缺失导致的卵泡异常闭锁的机制尚不清楚。卵泡内细胞的凋亡是导致卵泡闭锁的主要方式。BCL2L10、GDF9、BMP15在卵泡生长与闭锁过程中发挥重要作用,我们通过生物信息学分析发现Bcl2l10、Gdf9、Bmp15启动子区域存在多个SOHLH1结合位点（即E-Box）,三者可能受到SOHLH1的直接调控。BCL2L10属于BCL2蛋白家族成员中的抗凋亡因子,特异表达于各级卵泡的卵母细胞当中,与SOHLH1表达重叠于原始、初级卵泡阶段。BCL2L10能够结合在卵母细胞线粒体膜上,并与促凋亡因子BAX结合来维持线粒体膜的通透性,在卵母细胞线粒体凋亡途径中发挥抗凋亡作用。GDF9和BMP15都是同属TGFβ家族的生长因子,与SOHLH1表达重叠于初级卵泡阶段的卵母细胞当中。GDF9和BMP15旁分泌至细胞间隙,二者能够形成异源二聚体,并与颗粒细胞表面受体结合,活化颗粒细胞内的SMAD通路来调节颗粒细胞的生长与分化,主要在卵母细胞与颗粒细胞信号交流及调控颗粒细胞生长分化过程中发挥重要作用。基于前期工作基础及文献报道,我们推测SOHLH1很可能通过Bcl2l10、Gdf9、Bmp15影响原始卵泡和初级卵泡的闭锁过程,继而影响卵巢的卵泡储备及雌性小鼠的生育年龄。本研究旨在通过一系列形态学及分子生物学实验探讨Sohlh1（-/-）小鼠卵泡闭锁异常的原因及分子机制,为进一步明确Sohlh1基因功能及临床卵巢早衰、不孕不育等诊断和治疗提供理论依据。研究方法:本研究以出生后7.5天（PD7.5）Sohlh1（-/-）小鼠与同窝野生型C57BL/6J小鼠卵巢为研究对象,对比分析卵泡早期发育情况、凋亡情况、超微结构的变化情况;对同窝PD7.5 Sohlh1（-/-）与野生型小鼠的卵巢进行基因芯片分析,筛选与卵泡闭锁相关的候选基因;利用荧光素酶报告基因、染色质免疫沉淀实验对候选基因Bcl2l10、Bmp15、Gdf9是否受到转录因子SOHLH1的转录调控。结果:1.形态学观察发现,PD7.5 WT小鼠存在原始、初级、次级等各级卵泡结构,且卵泡储备数量充足;PD7.5 Sohlh1（-/-）小鼠与同窝WT型相比,卵泡储备不足、闭锁消失的原始卵泡数量增加,视野下不见正常初级卵泡,仅偶见有立方型颗粒细胞围绕,无卵母细胞的空泡样初级卵泡结构,在卵巢髓质和卵巢门位置有严重充血现象。2.TUNEL凋亡检测发现,PD7.5的Sohlh1（-/-）与WT小鼠相比,卵巢细胞大量凋亡。3.透射电镜观察小鼠PD7.5 Sohlh1（-/-）及同窝WT型小鼠卵巢发现,敲除小鼠中可观察到闭锁的卵巢中存在细胞凋亡与坏死,闭锁的卵泡中卵母细胞先于颗粒细胞发生凋亡,而WT型小鼠的卵泡则发育正常。4.利用小鼠基因表达谱芯片技术检测PD7.5 Sohlh1（-/-）及同窝WT型小鼠卵巢发现,敲除小鼠与WT相比,Sohlh1缺失可导致828个基因表达出现差异,对芯片数据用聚类分析经总结后发现,差异表达的基因主要集中在生殖相关类、凋亡类炎症类、细胞周期类减数分裂类、代谢相关类等影响卵泡发育相关类别。5.q PCR验证了部分与卵泡闭锁相关基因差异表达结果,与基因芯片结果趋势基本一致,包括生殖相关转录因子（Figla、Nobox、Pou5f1）、TGFβ家族成员（Gdf9、Bmp15）、其它生殖相关基因（Nlrp5、Nlrp14、Oosp1、Fshr）、细胞周期类（Cdk4、Ccnd2）、凋亡相关基因（Bax、Bad、Bcl2l10）在敲除小鼠卵巢中表达明显下调,而另一些凋亡基因（Bcl2、Caspase3）表达上调。6.我们在上述基因中发现Gdf9、Bmp15、Bcl2l10基因启动子区域存在多个Sohlh1结合位点,利用双荧光素酶报告基因实验证实,Sohlh1对Gdf9、Bmp15、Bcl2l10的启动子区域具有转录激活作用。7.染色质免疫沉淀Ch IP实验证实,Sohlh1能够结合Gdf9、Bmp15、Bcl2l10启动子上游的多个含有E-Box位点的区域。结论:1.卵巢内细胞发生凋亡与坏死是引起Sohlh1（-/-）小鼠卵泡闭锁加速的重要原因,且卵泡的闭锁始于卵母细胞发生凋亡。2.在PD7.5小鼠卵巢中,Sohlh1的缺失可导致828个基因表达出现差异,筛选出卵泡闭锁相关候选基因并分类,包括生殖相关类、凋亡类、炎症相关类、减数分裂与细胞周期类、代谢相关类基因,这些基因表达的异常可能是Sohlh1（-/-）小鼠卵巢闭锁加速的重要原因。3.SOHLH1能够直接与卵泡发育相关基因Bmp15,Gdf9,Bcl2l10启动子区域内的多个位点特异结合,并具有转录激活作用。
李桂明[8]（2020）在《热应激影响蛋鸡等级前卵泡发育的机理研究》文中认为在热带和温带地区,环境温度经常超过30℃,家禽易遭受热应激造成巨大的经济损失,蛋鸡在产蛋期（约300天）受到热应激损失更大。尽管已证实热应激影响蛋鸡产蛋率,但热应激影响蛋鸡卵泡发育影响的机制尚未完全清楚。卵泡发育缓慢甚至闭锁,可能与引起细胞凋亡的通路相关,而激活Fas L/Fas和TNF-α信号通路均可引起各种组织的细胞凋亡;但蛋鸡遭受热应激时,是否会通过激活这两个系统诱导卵泡细胞凋亡从而降低产蛋率尚无报道。所以,研究Fas L/Fas和TNF-α系统在热应激影响蛋鸡卵泡发育中的作用机理,对缓解蛋鸡热应激提高蛋鸡生产性能具有重要理论意义。本研究首先建立蛋鸡热应激模型,在模型基础上检测分析了热应激5天后对蛋鸡卵泡发育、蛋鸡卵泡颗粒凋亡、Fas和TNF-α系统激活、诱导氧化损伤、应激相关激素分泌等方面的影响,并进行了解除热应激后蛋鸡生产性能与卵泡恢复情况的研究,为临床解除热应激的影响提供理论依据。主要试验结果如下:（1）蛋鸡热应激模型的建立。选用32周龄海兰褐蛋鸡,通过产蛋率、死亡率、促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、皮质酮（Cort）等指标确定热应激的模式、温度与时间。首先进行了热应激模式与温度的筛选确定在35-37℃温度下连续热应激,试验鸡各项指标符合模型建立的要求;随后在此条件下热应激7天（S1-S7）,检测和分析发现,S5天试验鸡的各项指标基本稳定;因此,确定热应激模型条件为:35-37℃连续热应激5天。（2）热应激对蛋鸡卵泡发育的影响。依据蛋鸡热应激模型结果,检测热应激对蛋鸡卵泡发育的影响。各级卵泡数量统计发现,热应激组大白卵泡（LWF）和小黄卵泡（SYF）数量与对照组差异不显着（P>0.05）,但大黄卵泡（LYF）和等级卵泡（Hie）数量显着减少（P<0.05）。从热应激第3天到恢复期第6天,应激组母鸡的产蛋率显着低于对照组（P<0.05）;从恢复期第7天开始产蛋率逐步恢复到对照组水平。结合本研究的分类标准推测:S3-5、R1-3、R4-6时间段产蛋率的显着下降是由于发生了等级卵泡、LYF、SYF的应激损伤。（3）热应激对蛋鸡卵泡颗粒凋亡的影响。细胞凋亡是引起卵泡发育受阻的重要作用机理之一,因此通过TUNEL、流式细胞术等方法检测蛋鸡卵泡颗粒凋亡情况,同时开展相关凋亡蛋白与基因检测。研究发现,热应激组蛋鸡SYF和LYF卵泡颗粒细胞的凋亡率显着高于对照组（P<0.05）;应激组SYF和LYF卵泡颗粒细胞Caspase-3蛋白水平显着升高（P<0.05）;应激组SYF和LYF卵泡颗粒细胞Bcl-2基因表达及Bcl-2/Bax比值显着低于对照组（P<0.05）;综上,说明热应激显着诱导了蛋鸡卵泡颗粒细胞的凋亡。（4）热应激导致蛋鸡卵泡颗粒细胞凋亡通路研究。依据网络药理学方法初步探索Hsps蛋白家族参与调节细胞凋亡的相关机理;检测蛋鸡卵泡颗粒细胞中凋亡相关系统Fas和TNF-α的蛋白水平变化,探究热应激导致蛋鸡卵泡颗粒细胞凋亡的机理。结果显示:CDK1等10个Hsps家族蛋白参与了蛋鸡细胞凋亡,但尚需进一步验证;热应激组蛋鸡SYF和LYF卵泡颗粒细胞中Fas L、TNF-α和TNFR1蛋白表达量显着升高（P<0.05）,SYF和LYF卵泡液中Fas L和TNF-α的浓度显着升高（P<0.05）,说明热应激激活了蛋鸡卵泡中的Fas和TNF-α系统。（5）热应激诱导氧化损伤的研究。热应激通常首先导致氧化应激,所以本研究进行了蛋鸡血清和卵泡中SOD、MDA等氧化指标的检测。结果显示,热应激组蛋鸡血液TAS水平较对照组有所降低,但差异不显着;热应激组血液、小黄和大黄卵泡中SOD水平较对照组均显着降低（P<0.05）;MDA水平在血液、小黄、大黄卵泡中均显着升高（P<0.05）;说明热应激导致了机体氧化应激。（6）热应激对应激相关激素分泌的影响。为分析热应激对应激相关激素的影响,检测了蛋鸡卵泡中雌二醇（E2）和孕酮（P4）激素含量,以及血清与卵泡中CRH和皮质酮含量。结果显示,热应激组蛋鸡SYF和LYF中E2的浓度均显着低于对照组（P<0.05）;LYF中P4浓度显着高于对照组（P<0.05）,但SYF中P4较对照组差异不显着（P>0.05）;热应激组LYF中的E2/P4比值显着低于对照组（P<0.05）,这与哺乳动物闭锁卵泡中的E2/P4比值显着下降一致。热应激组血清、小黄和大黄卵泡CRH较对照组均显着升高（P<0.05）;皮质酮水平也显着升高（P<0.05）。（7）解除热应激对蛋鸡生产性能与卵泡发育影响的研究。为分析解除热应激后蛋鸡生产性能与卵泡发育的恢复情况,检测了蛋鸡各级卵泡数量、蛋品质和皮质酮分泌量。结果显示,应激组LWF和SYF数量较对照组差异不显着,LYF与等级卵泡在R7天即恢复到对照组水平;蛋重和蛋壳强度在R5天基本恢复但不稳定,到R11天后恢复到对照组水平;皮质酮检测发现,R7天已恢复到正常水平但有波动,R12天时恢复到了正常水平;在R7和R12天对小黄卵泡进行切片HE染色,未发现S5天时出现的水肿和空泡变性。可见,解除热应激7天后卵泡发育与生产性能基本恢复。综上所述,热应激导致了蛋鸡血液和卵泡中CRH与皮质酮的升高,继而发生卵泡氧化应激,激活了Fas/Fas L和TNFα/TNFR1信号通路,降低了E2/P4比值导致卵泡颗粒细胞凋亡,从而导致卵泡发育受阻或闭锁,产蛋率降低。
刘春洁[9]（2020）在《绵羊卵泡颗粒细胞中POSTN基因的表达调控及功能研究》文中认为调控卵巢卵泡发育是提高动物繁殖效率的主要途径之一。哺乳动物卵泡发育过程中,99.9%以上的卵泡会发生闭锁退化并消失,早期的一些报道指出,卵泡闭锁与卵泡颗粒细胞（Granulosa cell,GCs）凋亡密切相关,但GCs凋亡调控机制仍不完全清楚。本课题组前期采用FSH超排处理成年母羊,获得不同直径卵泡液和GCs,基于RNA-seq高通量测序和iTRAQ定量蛋白组学联合分析发现,随着卵泡直径的增加,卵泡液和GCs中POSTN表达量逐渐升高。因此提出假设:卵泡发育过程中,FSH与POSTN可能存在一定的相关性,但其具体调节机制尚不清楚。本论文以绵羊卵泡及GCs为研究对象,系统地探究POSTN在卵泡发育过程中表达规律及FSH-POSTN存在的表达调控机制,主要试验结果如下:1.绵羊POSTN基因cDNA的克隆及表达分析。绵羊中克隆出1557 bp长的POSTN cDNA序列,可编码由518个氨基酸组成的蛋白,克隆的绵羊POSTN与牦牛和奶牛同源性较近。POSTN基因在绵羊心、肝、脾、肺、肾、肌肉、子宫和卵巢组织中均有表达,其中卵巢组织中表达量较高,而且随着卵泡直径增加,POSTN表达量逐渐升高,且在卵泡中的GCs中呈高表达。免疫荧光染色发现POSTN在GCs的细胞核和细胞质中都有分布。试验进一步利用RAI法检测不同直径卵泡液和GCs中激素与POSTN含量变化,结果显示,POSTN在不同直径卵泡液和GCs中的变化与FSH存在显着正相关性,表明POSTN可能参与调节卵泡发育进程,而这一过程可能受FSH影响。2.FSH对绵羊卵泡GCs中POSTN的表达具有调节作用。采用10 ng/mL FSH对体外培养GCs处理24 h,能显着增加GCs中POSTN表达,并加速细胞增殖进程,减少其凋亡,还有效促进GCs增殖相关基因PCNA、Ccnd-2和抗凋亡相关基因Bcl-2表达。另外,敲减GCs中POSTN基因,能显着降低FSH条件下引起的POSTN表达上调,并抑制GCs增殖、分化过程,增加其凋亡,同时下调GCs增殖分化基因PCNA、Ccnd-2与抗凋亡基因Bcl-2的转录,上调凋亡相关基因Bim、FasL和Caspase-3的表达。3.FSH通过PI3K-AKT-FOXO1信号通路调控POSTN表达。检测FSH涉及的多条信号通路,发现绵羊卵泡GCs中FSH主要通过激活PI3K、AKT和FOXO1信号通路影响POSTN表达,进而抑制GCs凋亡。进一步分析PI3K、AKT和FOXO1三者关系,结果显示FSH处理能同时激活这三种激酶活性;阻断PI3K或AKT后,FSH对FOXO1激活作用被阻断;而阻断FOXO1后,PI3K和AKT活性不受影响。PI3K抑制剂能同时阻断FSH对AKT和FOXO1的诱导,而AKT抑制剂能阻断FOXO1活性但不能阻断PI3K活性。另外还发现阻断AKT后,POSTN的表达量显着降低,即使加入10 ng/mL FSH在24 h内也无法恢复上调POSTN的转录,未能完全挽救GCs凋亡过程。4.FSH通过调节转录因子SRF调控POSTN表达。分析POSTN转录调控区,发现POSTN上游-1至-387 bp区域内包含1个SRF和1个JunD结合位点,进一步对结合位点定点突变分析,发现位于-222至-210的SRF结合位点突变明显降低了POSTN转录活性;同时还发现10 ng/mL FSH处理GCs 24 h后,能促进SRF表达,实现POSTN转录增强,该结果与ChIP分析结果相一致。因此推测,适量FSH一定时间内可能通过调节转录因子SRF调控POSTN表达,表明SRF可能是FSH调节POSTN表达以促进GCs生长的核心因子。综上所述,本论文主要围绕POSTN在绵羊卵泡GCs凋亡及卵泡闭锁中的作用及其分子调控机制进行了研究,建立了 FSH、POSTN,GCs凋亡和卵泡存活之间的联系,发现了 FSH-PI3K-AKT-FOXO1信号轴与GCs中POSTN表达的调控机制。本论文结果有助于进一步阐明卵泡存活/闭锁的分子机制,也为提高家畜繁殖效率提供新的理论基础。
李婷婷[10]（2020）在《TIPE1表达促凋亡机制对卵巢癌和颗粒细胞的影响》文中指出研究背景:多项研究表明TIPE1在各种癌症肿瘤中参与细胞凋亡,可预测病人的预后,是一种癌症的识别生物标志物。但在卵巢癌中,TIPE1的临床意义、生物学功能尚未阐明。而卵巢颗粒细胞的凋亡能影响卵泡发育,因此研究TIPE1在卵巢颗粒细胞中的作用,颗粒细胞是卵子周围的大细胞群,从而探讨TIPE1对卵子发育环境可能的影响。研究目的:探讨TIPE1在卵巢癌组织中表达的临床意义;TIPE1在卵巢癌和卵巢颗粒细胞中的作用,以及TIPE1促凋亡的机制。研究方法1.用组织芯片免疫组化、qRTPCR、免疫蛋白印迹等方法检测TIPE1在卵巢癌组织中的表达,分析90例卵巢癌临床样品中TIPE1的表达以及和生存预后的关系。2.通过感染慢病毒建立稳定的TIPE1高表达A2780、SKOV-3卵巢癌细胞株,构建卵巢癌细胞模型,用CCK-8、克隆形成实验、流式细胞凋亡实验,Balb/c裸鼠成瘤实验等方法,观察TIPE1对卵巢癌细胞活性和凋亡的影响。3.通过感染慢病毒建立稳定的TIPE1高表达卵巢颗粒细胞株,构建卵巢颗粒细胞模型,用CCK-8、克隆形成实验、流式细胞凋亡实验,电化学发光法等方法,观察TIPE1对颗粒细胞活性和凋亡的影响,以及对颗粒细胞合成和分泌雌激素的影响。4.通过用qRTPCR、免疫蛋白印迹、组织免疫荧光实验等方法分析卵巢癌细胞和颗粒细胞模型中,caspase 3、caspase 8和caspase 9的表达情况,探讨卵巢癌细胞和颗粒细胞中TIPE1对效应凋亡蛋白caspases表达的影响。在高表达了TIPE1的卵巢癌细胞和颗粒细胞中用z-VAD抑制caspases的表达,验证TIPE1通过促进caspases表达来发挥促凋亡作用。研究结果:1.TIPE1在卵巢癌组织和细胞系中低表达;TIPE1表达水平与卵巢癌患者预后不良之间存在负相关关系。2.体内及体外实验均证实,TIPE1高表达能够抑制卵巢癌细胞活性和增殖,以及诱导细胞凋亡。3.TIPE1高表达能够抑制颗粒细胞活性和增殖,诱导细胞凋亡。4.TIPE1高表达能促进卵巢癌细胞和颗粒细胞中caspases（3、8和9）的表达,促进细胞凋亡。研究结论:1.TIPE1可作为预测卵巢癌患者不良预后的潜在标记物。2.TIPE1通过促进caspases表达抑制卵巢癌细胞和颗粒细胞增殖。
二、卵泡闭锁与颗粒细胞凋亡（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、卵泡闭锁与颗粒细胞凋亡（论文提纲范文）
（1）视黄醇结合蛋白4对猪卵泡颗粒细胞功能的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 哺乳动物卵泡发育调控的研究进展 |
| 1.1 哺乳动物卵泡发育的特点 |
| 1.2 哺乳动物卵泡发育和闭锁的调控 |
| 1.3 颗粒细胞对哺乳动物卵泡发育和闭锁的影响 |
| 第2章 RBP4的研究进展 |
| 2.1 RBP蛋白简介 |
| 2.2 RBP基因简介 |
| 2.3 RBP4生物学功能 |
| 第3章 RBP4在动物繁殖中的研究进展 |
| 3.1 RBP4的基因多态性与母猪繁殖性能 |
| 3.2 RBP4在生殖系统中的表达和定位 |
| 3.3 RBP4与卵巢颗粒细胞 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 pLVX-RBP4慢病毒过表达载体的构建、包装和鉴定与si RNA干扰效果研究 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 RBP4对猪卵泡颗粒细胞凋亡和孕酮分泌的影响 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 RBP4调控猪卵泡颗粒细胞功能的分子机制解析 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 RBP4通过ERK1/2通路调控猪卵泡颗粒细胞凋亡和孕酮分泌的机制研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读博士期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）Wnt/β-Catenin信号通路的激活或抑制对水牛颗粒细胞雌二醇和孕酮合成的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写词中英文对照表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 卵泡颗粒细胞的研究进展 |
| 1.1 颗粒细胞简介 |
| 1.2 颗粒细胞的分子标记 |
| 1.3 颗粒细胞与卵泡发育 |
| 1.4 颗粒细胞培养 |
| 2 雌二醇和孕酮的研究进展 |
| 2.1 雌二醇和孕酮的合成 |
| 2.2 雌二醇和孕酮合成关键酶 |
| 2.3 雌二醇和孕酮的功能 |
| 2.4 雌二醇和孕酮在月经周期中的变化 |
| 3 Wnt/β-Catenin信号通路在雌性生殖中的研究进展 |
| 3.1 Wnt蛋白家族 |
| 3.2 Wnt/β-Catenin信号通路 |
| 3.3 Wnt/β-Catenin信号通路与卵泡发育 |
| 3.4 Wnt/β-Catenin信号通路与颗粒细胞的增殖和凋亡 |
| 3.5 Wnt/β-Catenin信号通路与颗粒细胞类固醇生成 |
| 4 Wnt/β-Catenin信号通路在水牛上的研究进展 |
| 5 研究的目的与意义 |
| 第二部分 课题研究 |
| 第一章 颗粒细胞的无血清培养和Wnt3a的表达分析 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 试验设计 |
| 1.4 数据处理与统计学分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 颗粒细胞的鉴定以及无血清培养对颗粒细胞生长的影响 |
| 2.2 Wnt3a在水牛不同大小卵泡的颗粒细胞中的表达情况 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 Wnt/β-Catenin信号通路的激活对颗粒细胞雌二醇和孕酮合成的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 试验设计 |
| 1.4 数据处理与统计学分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 不同浓度Wnt3a对颗粒细胞增殖的影响 |
| 2.2 不同浓度Wnt3a对颗粒细胞雌二醇和孕酮合成的影响 |
| 2.3 不同浓度Wnt3a对雌二醇和孕酮合成关键酶基因表达的影响 |
| 2.4 不同浓度Wnt3a对雌二醇和孕酮合成关键酶蛋白表达的影响 |
| 2.5 Wnt3a对颗粒细胞凋亡的影响 |
| 2.6 Wnt3a对Wnt/β-Catenin信号通路相关蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 Wnt/β-Catenin信号通路的抑制对颗粒细胞雌二醇和孕酮合成的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 试验设计 |
| 1.4 数据处理与统计学分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 不同浓度XAV939对颗粒细胞增殖的影响 |
| 2.2 不同浓度XAV939对颗粒细胞雌二醇和孕酮合成的影响 |
| 2.3 不同浓度XAV939对雌二醇和孕酮合成关键酶基因表达的影响 |
| 2.4 不同浓度XAV939对雌二醇和孕酮合成关键酶蛋白表达的影响 |
| 2.5 XAV939对颗粒细胞凋亡的影响 |
| 2.6 XAV939对Wnt/β-Catenin信号通路相关蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间参与论文发表情况 |
（3）BMP15通过BMPR1B调控陕北白绒山羊卵泡颗粒细胞功能的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 哺乳动物的卵泡发育和卵泡闭锁 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 哺乳动物的卵泡结构和卵泡发育 |
| 1.3 哺乳动物的卵泡闭锁 |
| 1.4 颗粒细胞在卵泡发育中的作用 |
| 1.4.1 颗粒细胞增殖在卵泡发育中的作用 |
| 1.4.2 颗粒细胞凋亡在卵泡发育中的作用 |
| 1.4.3 颗粒细胞分泌C型钠肽对卵母细胞的作用 |
| 第二章 BMPR1B基因研究进展 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 BMPR1B基因的发现和定位 |
| 2.3 BMPR1B基因结构和蛋白结构 |
| 2.4 BMPR1B在绵羊和山羊各器官和组织中的表达 |
| 2.5 BMPR1B参与的信号通路 |
| 2.5.1 BMP15 |
| 2.5.2 TGFβ/Smad信号转导通路 |
| 2.6 BMPR1B基因的生物学功能 |
| 2.6.1 BMPR1B对繁殖性能的影响 |
| 2.6.2 BMPR1B对羊毛细度的调控作用 |
| 2.6.3 BMPR1B对骨骼发育及维持的作用 |
| 2.6.4 BMPR1B对肿瘤的影响 |
| 2.6.5 BMPR1B的其它生物学功能 |
| 2.7 本研究的目的意义 |
| 2.8 本研究的技术路线图 |
| 试验研究 |
| 第三章 陕北白绒山羊BMPR1B基因的序列特征与表达模式研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 山羊BMPR1B m RNA序列的克隆及多态性分析 |
| 3.2.2 山羊BMPR1B氨基酸序列特征分析 |
| 3.2.3 BMPR1B在不同产羔数绒山羊组织中的差异表达分析 |
| 3.2.4 BMPR1B在不同大小卵泡及卵母细胞和颗粒细胞中的表达分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 BMP15 对绒山羊卵泡颗粒细胞生物学功能的调控作用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 山羊卵泡颗粒细胞的分离培养 |
| 4.2.2 山羊卵泡颗粒细胞的鉴定 |
| 4.2.3 BMP15 对山羊卵泡颗粒细胞增殖的影响 |
| 4.2.4 BMP15 对山羊卵泡颗粒细胞凋亡的影响 |
| 4.2.5 BMP15 对山羊卵泡颗粒细胞类固醇激素合成的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 BMP15对绒山羊卵泡颗粒细胞BMPR1B及Smad通路和MAPK通路的调控作用 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 BMP15对BMPR2和BMPR1B表达的影响 |
| 5.2.2 BMP15对BMPR1B的表达调控 |
| 5.2.3 BMP15对Smad信号通路的影响 |
| 5.2.4 BMP15协同FSH对类固醇激素分泌的影响 |
| 5.2.5 BMP15对MAPK信号通路的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 BMP15通过BMPR1B对绒山羊卵泡颗粒细胞的调控作用研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试验材料 |
| 6.1.2 试验方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 BMPR1B过表达载体的构建 |
| 6.2.2 BMPR1B干扰载体的构建和筛选 |
| 6.2.3 慢病毒包装纯化及滴度测定 |
| 6.2.4 卵泡颗粒细胞BMPR1B基因过表达及干扰效率检测 |
| 6.2.5 BMP15通过BMPR1B对卵泡颗粒细胞增殖的影响 |
| 6.2.6 BMP15通过BMPR1B对卵泡颗粒细胞凋亡的影响 |
| 6.2.7 BMP15通过BMPR1B对卵泡颗粒细胞类固醇激素合成的影响 |
| 6.2.8 BMP15通过BMPR1B对Smad信号通路和MAPK信号通路的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 总结论 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 下一步需要研究的主要问题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 主要试验仪器 |
| 附录二 主要试验试剂与耗材 |
| 附录三 试验操作步骤 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）MiR-99a调控猪颗粒细胞增殖凋亡的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 、文献综述 |
| 1.1 miRNA的研究进展 |
| 1.1.1 miRNA的定义和研究方法 |
| 1.1.2 miRNA的生物合成和作用机制 |
| 1.1.3 miRNA的研究方向 |
| 1.2 miRNA对卵泡发育的影响 |
| 1.2.1 miRNA对哺乳动物生殖功能的调控 |
| 1.2.2 miRNA通过调节颗粒细胞的生长对卵泡发育的影响 |
| 1.2.3 不同闭锁程度卵泡中miRNAs在颗粒细胞中的差异表达及对颗粒细胞凋亡的调控 |
| 1.2.4 miR-99a的研究进展 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 第二章 、miR-99a调控猪颗粒细胞增殖凋亡的作用机制研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 组织、细胞和菌株 |
| 2.1.2 载体与质粒 |
| 2.1.3 工具酶及主要试剂 |
| 2.1.4 主要培养基及其制备 |
| 2.1.5 Western Blot实验所需材料 |
| 2.1.6 主要缓冲液与相关试剂及其制备 |
| 2.1.7 主要实验仪器及设备 |
| 2.1.8 引物设计与合成 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 不同闭锁程度卵泡的分离 |
| 2.2.2 细胞的分离与培养 |
| 2.2.3 组织样品总RNA的提取 |
| 2.2.4 反转录及PCR |
| 2.2.5 PCR产物或酶切产物的电泳检测 |
| 2.2.6 PCR产物或酶切产物的回收与纯化 |
| 2.2.7 限制性内切酶酶切反应 |
| 2.2.8 外源DNA片段与质粒载体的连接反应 |
| 2.2.9 连接产物的转化 |
| 2.2.10 重组质粒的制备与鉴定 |
| 2.2.11 质粒与miRNA的转染(脂质体介导的瞬时转染法) |
| 2.2.12 双荧光素酶检测 |
| 2.2.13 细胞活力检测(CCK-8 法) |
| 2.2.14 细胞增殖/毒性检测(CCK-8 法) |
| 2.2.15 细胞周期检测(PI法) |
| 2.2.16 细胞凋亡检测(FITC/PI双染法) |
| 2.2.17 流式细胞术 |
| 2.2.18 生物信息学分析 |
| 2.2.19 统计学方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 miR-99a在不同闭锁程度的猪卵泡中的表达 |
| 2.3.2 miR-99a的生物信息学分析及靶基因预测 |
| 2.3.3 miR-99a靶向mTOR基因的双荧光素酶报告实验验证 |
| 2.3.4 离体猪颗粒细胞代数的选择与miRNA的转染条件 |
| 2.3.5 过表达miR-99a抑制猪颗粒细胞增殖 |
| 2.3.6 过表达/抑制miR-99a对猪颗粒细胞的细胞周期的影响 |
| 2.3.7 过表达/抑制miR-99a对猪颗粒细胞凋亡的影响 |
| 2.3.8 过表达/抑制miR-99a对猪颗粒细胞中基因表达的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 miR-99a在不同闭锁程度卵泡中的表达水平与作用途径 |
| 2.4.2 miR-99a靶基因的预测与分析 |
| 2.4.3 miR-99a靶向m TOR对颗粒细胞增殖的影响 |
| 2.4.4 miR-99a对颗粒细胞凋亡的影响 |
| 2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（5）miR-184调控猪卵巢颗粒细胞雌二醇合成、增殖和凋亡的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 颗粒细胞与卵泡发育过程 |
| 1.1.1 雌二醇合成与卵泡发育 |
| 1.1.2 颗粒细胞增殖与卵泡发育 |
| 1.1.3 颗粒细胞凋亡与卵泡发育 |
| 1.2 miRNA的形成及作用机制 |
| 1.2.1 miRNA的形成 |
| 1.2.2 miRNA的作用机制 |
| 1.3 miRNA调控颗粒细胞功能的研究进展 |
| 1.3.1 调控颗粒细胞雌二醇合成的miRNA |
| 1.3.2 调控颗粒细胞增殖的miRNA |
| 1.3.3 调控颗粒细胞凋亡的miRNA |
| 1.4 miR-184 的研究进展 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 第二章 miR-184 的表达特征分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.1.3 数据统计与分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 miR-184 的保守性及在高低产母猪卵巢组织中的差异表达 |
| 2.2.2 miR-184 靶基因的通路富集分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 miR-184 调控猪卵巢颗粒细胞雌二醇合成的作用及机制研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.1.3 数据统计与分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 过表达miR-184 促进猪卵巢颗粒细胞的雌二醇合成 |
| 3.2.2 过表达miR-184 促进雌二醇合成关键基因的表达 |
| 3.2.3 干扰miR-184 抑制猪卵巢颗粒细胞的雌二醇合成 |
| 3.2.4 干扰miR-184 抑制雌二醇合成关键基因的表达 |
| 3.2.5 miR-184 在雌二醇合成方面的靶基因预测 |
| 3.2.6 miR-184 抑制NR1D1 的表达 |
| 3.2.7 NR1D1 能够减弱miR-184 对雌二醇合成的促进作用 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 miR-184 调控猪卵巢颗粒细胞增殖的作用及机制研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.1.3 数据统计与分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 过表达miR-184 促进猪卵巢颗粒细胞增殖 |
| 4.2.2 过表达miR-184 促进颗粒细胞周期相关基因的表达 |
| 4.2.3 干扰miR-184 抑制猪卵巢颗粒细胞增殖 |
| 4.2.4 干扰miR-184 抑制颗粒细胞周期相关基因的表达 |
| 4.2.5 miR-184 在颗粒细胞增殖方面的靶基因预测 |
| 4.2.6 miR-184 抑制p21 的表达 |
| 4.2.7 p21 能够减弱miR-184 对颗粒细胞增殖的促进作用 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 miR-184 调控猪卵巢颗粒细胞凋亡的作用及机制研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.1.3 数据统计与分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 过表达miR-184 对颗粒细胞凋亡相关基因的作用 |
| 5.2.2 干扰miR-184 促进猪卵巢颗粒细胞的凋亡 |
| 5.2.3 干扰miR-184 对颗粒细胞凋亡相关基因的作用 |
| 5.2.4 miR-184 在颗粒细胞凋亡方面的靶基因预测 |
| 5.2.5 miR-184 抑制了 HIPK2 的表达 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 下一步研究计划 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）低温导致四川华鳊卵泡闭锁的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 鱼类卵泡发育与闭锁 |
| 1.1.1 卵巢和卵泡结构 |
| 1.1.2 卵母细胞的生长和成熟 |
| 1.1.3 卵巢发育模式 |
| 1.1.4 卵泡闭锁 |
| 1.2 卵泡发育与闭锁的调控因子 |
| 1.2.1 促性腺激素和类固醇激素与卵泡闭锁 |
| 1.2.2 细胞因子与卵泡闭锁 |
| 1.2.3 凋亡相关基因与卵泡闭锁 |
| 1.3 温度对鱼类卵泡发育的影响 |
| 1.4 四川华鳊概述 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验鱼处理 |
| 2.2.2 卵巢和卵母细胞的形态学与组织学观察 |
| 2.2.3 胚胎发育情况统计 |
| 2.2.4 卵巢组织转录组测序及分析 |
| 2.2.5 血清促性腺激素和类固醇激素水平检测 |
| 2.2.6 细胞凋亡检测 |
| 2.2.7 数据处理 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 26℃条件下四川华鳊繁殖周期的确定 |
| 3.2 低温对四川华鳊卵巢发育的影响 |
| 3.3 基于转录组测序探究低温导致四川华鳊卵泡闭锁的机制 |
| 3.3.1 测序数据的组装与注释 |
| 3.3.2 低温对促性腺激素和类固醇激素合成和作用的影响 |
| 3.3.3 低温对细胞凋亡的影响 |
| 3.3.4 Real-time PCR验证候选基因 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 26℃条件下四川华鳊繁殖周期的确定及意义 |
| 4.2 低温导致的四川华鳊卵泡闭锁现象 |
| 4.3 低温导致四川华鳊卵泡闭锁的调控机制 |
| 4.3.1 低温使促性腺激素和类固醇激素合成和作用受阻 |
| 4.3.2 低温使卵泡细胞凋亡加剧 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文及参加科研情况 |
| 致谢 |
（7）Sohlh1基因敲除小鼠卵泡闭锁异常及其机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:PD7.5Sohlh1基因敲除小鼠卵泡发育形态学分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 技术路线 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 小鼠基因型的鉴定 |
| 2.3.2 PD7.5雌鼠卵巢Sohlh1 mRNA表达检测 |
| 2.3.3 PD7.5小鼠卵巢石蜡切片制作 |
| 2.3.4 PD7.5小鼠卵巢HE染色 |
| 2.3.5 PD7.5小鼠卵巢TUNEL凋亡检测 |
| 2.3.6 PD7.5小鼠卵巢透射电镜观察 |
| 3 结果 |
| 3.1 Sohlh1基因敲除小鼠基因型的鉴定及Sohlh1的mRNA表达分析 |
| 3.2 PD7.5小鼠卵巢HE染色结果 |
| 3.3 PD7.5小鼠卵巢TUNEL凋亡检测结果 |
| 3.4 PD7.5小鼠卵巢透射电镜观察结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:Sohlh1基因敲除小鼠卵泡闭锁候选基因的筛选 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 技术路线 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 基因芯片筛查Sohlh1(-/-)与WT小鼠卵巢差异表达基因 |
| 2.3.2 PD7.5小鼠卵巢RNA的提取 |
| 2.3.3 RNA反转录为cDNA |
| 2.3.4 qPCR检测相关基因的表达 |
| 2.3.5 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 基因芯片筛查Sohlh1(-/-)与WT小鼠卵巢差异表达基因 |
| 3.1.1 基因芯片聚类分析 |
| 3.1.2 基因芯片GO分析和Pathway分析 |
| 3.1.3 候选基因分类 |
| 3.2 qPCR验证部分候选基因芯片结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:SOHLH1对Bcl2l10、Gdf9、Bmp15基因转录调控作用的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 细胞及菌株 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.2 技术路线 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 Bcl2l10、Gdf9、Bmp15基因转录启动子区域转录结合位点分析 |
| 2.3.2 Bmp15、Gdf9、Bcl2l10启动子区的克隆及荧光素酶表达质粒的构建 |
| 2.3.3 双荧光素酶报告基因检测Sohlh1对Bcl2l10、Gdf9、Bmp15启动子活性的影响 |
| 2.3.4 染色质免疫沉淀(ChIP)结合PCR验证在体内条件下转录因子Sohlh1与基因启动子特异序列的结合 |
| 3 结果 |
| 3.1 Bmp15、Gdf9、Bcl2l10起始位点上游E-Box位点分析 |
| 3.2 Bcl2l10、Gdf9、Bmp15启动子区域荧光素酶表达质粒的构建 |
| 3.3 荧光素酶报告基因检测转录因子SOHLH1对Bcl2l10、Gdf9、Bmp15启动子转录活性的影响 |
| 3.4 染色质免疫沉淀(ChIP)验证转录因子SOHLH1 能否结合Bmp15、Gdf9、Bcl2l10启动子区域 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 Bmp15和Gdf9在卵巢中生物学功能的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（8）热应激影响蛋鸡等级前卵泡发育的机理研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 热应激对蛋鸡生产性能的影响 |
| 1.1.1 蛋鸡对热耐受性的生理特点 |
| 1.1.2 热应激影响蛋鸡生产性能的研究 |
| 1.1.3 蛋鸡热应激模型的研究概况 |
| 1.2 蛋鸡卵泡的发育 |
| 1.2.1 蛋鸡卵泡的生长发育 |
| 1.2.2 成年蛋鸡卵泡分级 |
| 1.2.3 卵泡的闭锁与选择 |
| 1.2.4 热应激对卵泡数量的影响 |
| 1.3 细胞凋亡及其信号通路 |
| 1.3.1 细胞凋亡 |
| 1.3.2 Caspase通路 |
| 1.3.3 Bcl-2与Bax通路 |
| 1.3.4 Fas/FasL信号通路 |
| 1.3.5 TNFα/TNFR信号通路 |
| 1.3.6 氧化应激与细胞凋亡 |
| 1.4 热应激对相关激素的影响 |
| 1.4.1 CRH与热应激 |
| 1.4.2 皮质酮与热应激 |
| 1.4.3 雌激素与热应激 |
| 1.4.4 孕酮与热应激 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验动物与饲养条件 |
| 2.1.2 主要设备 |
| 2.1.3 主要试剂及其配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 蛋鸡热应激动物模型的建立 |
| 2.2.2 蛋鸡热应激动物模型的验证 |
| 2.2.3 热应激对蛋鸡卵泡损伤的组织学观察 |
| 2.2.4 TUNEL法检测卵泡颗粒细胞凋亡 |
| 2.2.5 流式细胞仪检测卵泡颗粒细胞凋亡 |
| 2.2.6 Western blot检测卵泡颗粒细胞相关蛋白表达 |
| 2.2.7 荧光定量PCR检测卵泡颗粒细胞相关基因的表达 |
| 2.2.8 卵泡中FasL与TNF-α含量的检测 |
| 2.2.9 蛋鸡血清和卵泡氧化应激指标TAS、SOD及MDA的检测 |
| 2.2.10 网络药理学方法研究Hsps蛋白系统在细胞凋亡中的机理 |
| 2.2.11 血清和卵泡中孕酮和雌二醇激素含量的检测 |
| 2.2.12 蛋鸡卵泡中促肾上皮质激素释放激素和皮质酮含量的检测 |
| 2.2.13 解除热应激后蛋鸡生产性能恢复试验设计 |
| 2.3 统计方法 |
| 2.4 技术路线 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 蛋鸡热应激动物模型建立的研究 |
| 3.1.1 蛋鸡热应激模式及温度的确定 |
| 3.1.2 热应激持续时间对蛋鸡生产性能的影响 |
| 3.1.3 热应激对蛋鸡血液中促肾上腺素激素释放激素和皮质酮的影响 |
| 3.1.4 热应激持续时间对蛋鸡血液心肌酶的影响 |
| 3.2 热应激对蛋鸡卵泡发育的影响 |
| 3.2.1 热应激对蛋鸡产蛋率的影响 |
| 3.2.2 热应激对蛋鸡卵泡数量的影响 |
| 3.3 热应激对蛋鸡卵泡颗粒凋亡的影响 |
| 3.3.1 热应激对蛋鸡卵泡组织损伤的影响 |
| 3.3.2 TUNEL法检测热应激后卵泡颗粒细胞凋亡情况 |
| 3.3.3 流式细胞法检测热应激后卵泡颗粒细胞凋亡情况 |
| 3.3.4 热应激对蛋鸡卵泡颗粒细胞Caspase-3蛋白表达的影响 |
| 3.3.5 热应激对蛋鸡卵泡颗粒细胞相关凋亡基因表达的影响 |
| 3.4 热应激导致蛋鸡卵泡颗粒细胞凋亡通路研究 |
| 3.4.1 热应激对蛋鸡卵泡颗粒细胞FasL/Fas蛋白系统的影响 |
| 3.4.2 热应激对蛋鸡卵泡颗粒细胞TNF-α蛋白系统的影响 |
| 3.4.3 网络药理学方法分析Hsps蛋白系统在细胞凋亡中的作用 |
| 3.5 热应激对蛋鸡血清和卵泡氧化应激的影响 |
| 3.5.1 热应激对蛋鸡血清中相关氧化指标的影响 |
| 3.5.2 热应激对蛋鸡卵泡中SOD和MDA的影响 |
| 3.6 热应激对蛋鸡卵泡和血清激素水平的影响 |
| 3.6.1 热应激对蛋鸡血清和卵泡中雌二醇和孕酮激素含量的影响 |
| 3.6.2 热应激对蛋鸡血清与卵泡中促肾上腺皮质激素释放激素和皮质酮含量的影响 |
| 3.7 解除热应激对蛋鸡生产性能与卵泡发育影响的研究 |
| 3.7.1 解除热应激对蛋鸡各级卵泡数量变化的影响 |
| 3.7.2 解除热应激后蛋重与蛋品质的恢复研究 |
| 3.7.3 热应激解除前后蛋鸡血液皮质酮含量的变化研究 |
| 3.7.4 解除热应激后蛋鸡卵泡组织损伤恢复情况的研究 |
| 4 讨论 |
| 4.1 蛋鸡热应激模型的建立 |
| 4.2 热应激导致了蛋鸡等级前卵泡颗粒细胞凋亡 |
| 4.3 热应激激活蛋鸡卵泡颗粒细胞FasL/Fas与TNF-α通路 |
| 4.4 热应激导致蛋鸡血液及等级前卵泡氧化应激 |
| 4.5 热应激导致蛋鸡血液和卵泡相关激素含量改变 |
| 4.6 解除热应激后蛋鸡生产性能与卵泡组织的恢复 |
| 4.7 热应激影响蛋鸡卵泡发育的可能机理探讨 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 |
（9）绵羊卵泡颗粒细胞中POSTN基因的表达调控及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 FSH调节卵泡发育 |
| 1.1.1 FSH调节卵泡发育功能 |
| 1.1.2 FSH协同信号轴调节卵泡颗粒细胞功能 |
| 1.2 AKT信号通路相关生物学调控机制研究 |
| 1.2.1 PI3K-AKT信号通路的激活及通信过程 |
| 1.2.2 PI3K-AKT信号通路的生物学作用 |
| 1.3 PI3K-AKT信号通路调控卵泡发育机制研究 |
| 1.4 FOXO1转录因子的功能研究进展 |
| 1.4.1 FOXO1在细胞中的生物学调控功能 |
| 1.4.2 FOXO1在卵泡中的细胞生物学调控功能 |
| 1.5 POSTN生物功能研究 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 2 实验一 绵羊POSTN基因的克隆及表达分析 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验样品 |
| 2.1.2 主要试剂与药品 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 不同直径卵泡及黄体分离 |
| 2.2.2 不同直径卵泡中MGCs,TCs,COC和Oocyte的收集 |
| 2.2.3 RNA提取和反转录 |
| 2.2.4 POSTN基因cDNA克隆 |
| 2.2.5 胶回收及转化 |
| 2.2.6 POSTN基因cDNA生物信息学分析 |
| 2.2.7 qRT-PCR方法检测POSTN在绵羊不同组织中的表达 |
| 2.2.8 免疫组化检测绵羊卵巢中POSTN的表达 |
| 2.2.9 Western Blot法检测POSTN蛋白表达 |
| 2.2.10 免疫荧光检测GCs中POSTN的表达 |
| 2.2.11 不同直径腔卵泡液中POSTN和生殖激素浓度检测 |
| 2.2.12 统计分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 绵羊组织及卵泡GCs总RNA提取 |
| 2.3.2 POSTN cDNA序列的克隆及生物信息学分析 |
| 2.3.3 POSTN基因在绵羊不同组织中表达分析 |
| 2.3.4 POSTN在不同直径卵泡及卵泡细胞中的表达分析 |
| 2.3.5 POSTN在GCs的定位及表达 |
| 2.3.6 不同直径卵泡中POSTN和FSH、LH和17β-E_2含量水平 |
| 2.3.7 POSTN与FSH、LH和17β-E_2在不同直径卵泡中相关性分析 |
| 2.3.8 POSTN mRNA与FSHR、LHR和ER表达相关性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 实验二 FSH对绵羊卵泡GCs中POSTN的表达具有调节作用 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验样品 |
| 3.1.2 主要试验试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 卵泡GCs收集 |
| 3.2.2 绵羊GCs凋亡检测 |
| 3.2.3 FSH对体外培养的GCs的活性影响 |
| 3.2.4 FSH对体外培养的GCs细胞周期检测 |
| 3.2.5 POSTN siRNA化学合成 |
| 3.2.6 绵羊卵泡中GCs原代培养 |
| 3.2.7 POSTN siRNA细胞转染 |
| 3.2.8 转染POSTN-siRNA后GCs活性检测 |
| 3.2.9 转染POSTN-siRNA后GCs周期检测 |
| 3.2.10 转染POSTN-siRNA后GCs凋亡检测 |
| 3.2.11 GCs复苏及培养 |
| 3.2.12 GCs RNA提取和逆转录 |
| 3.2.13 qRT-PCR检测GCs中POSTN-siRNA转染效率 |
| 3.2.14 qPCR检测GCs中基因表达 |
| 3.2.15 Western Blot法检测蛋白表达 |
| 3.2.16 数据分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 不同浓度FSH对体外培养的GCs生长的影响 |
| 3.3.2 不同浓度FSH对体外培养的GCs凋亡影响 |
| 3.3.3 不同浓度FSH对体外培养的GCs周期影响 |
| 3.3.4 FSH对GCs中POSTN不同时期表达影响 |
| 3.3.5 FSH上调GCs中PCNA,Ccnd-2,Bcl-2和POSTN表达 |
| 3.3.6 POSTN-siRNA干扰效率检测 |
| 3.3.7 转染POSTN-siRNA对GCs活性的影响 |
| 3.3.8 转染POSTN-siRNA对GCs凋亡的影响 |
| 3.3.9 敲减POSTN可增加GCs凋亡 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 实验三 FSH通过AKT-FOXO1信号通路激活转录因子SRF调控POSTN表达 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 试验样品 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 绵羊卵泡中GCs分离和原代培养 |
| 4.2.2 GCs复苏及培养 |
| 4.2.3 蛋白激酶活性测定 |
| 4.2.4 GCs RNA提取和逆转录 |
| 4.2.5 绵羊POSTN启动子克隆及生物信息学分析 |
| 4.2.6 绵羊POSTN启动子5'缺失片段克隆及载体构建 |
| 4.2.7 目段片段与载体连接 |
| 4.2.8 GCs转染及相对荧光素酶活性分析 |
| 4.2.9 POSTN启动子转录因子结合位点突变分析 |
| 4.2.10 染色质免疫沉淀(ChIP) |
| 4.2.11 PCR扩增 |
| 4.2.12 统计学分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 FSH诱导的细胞信号通路对POSTN表达的影响 |
| 4.3.2 GCs中AKT和FOXO1磷酸化激活POSTN表达 |
| 4.3.3 FSH通过AKT/FOXO1信号通路调控GCs中POSTN表达 |
| 4.3.4 POSTN启动子克隆及分析 |
| 4.3.5 POSTN启动子不同大小片段的克隆及载体构建 |
| 4.3.6 POSTN启动子活性分析 |
| 4.3.7 POSTN启动子活性区转录因子结合位点突变分析 |
| 4.3.8 ChIP鉴定转录因子结合 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 全文总体结论、创新点 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 6 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（10）TIPE1表达促凋亡机制对卵巢癌和颗粒细胞的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 TIPE1在卵巢癌组织和细胞中的表达 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 5 参考文献 |
| 第二章 TIPE1对卵巢癌细胞功能的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结纶 |
| 5 参考文献 |
| 第三章 TIPE1对卵巢颗粒细胞功能的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 5 参考文献 |
| 第四章 TIPE 1促进caspases表达的促凋亡机制 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 5 参考文献 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 在读期间发表文章 |
| 综述一 TIPE1在卵巢癌的研究进展及展望 |
| 5 参考文献 |
| 综述二 卵巢颗粒细胞与雌激素对女性生育力的影响 |
| 5 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 致谢 |
四、卵泡闭锁与颗粒细胞凋亡（论文参考文献）
- [1]视黄醇结合蛋白4对猪卵泡颗粒细胞功能的影响及其机制研究[D]. 赵云. 吉林大学, 2021(01)
- [2]Wnt/β-Catenin信号通路的激活或抑制对水牛颗粒细胞雌二醇和孕酮合成的影响[D]. 余庆. 广西大学, 2021(12)
- [3]BMP15通过BMPR1B调控陕北白绒山羊卵泡颗粒细胞功能的分子机制[D]. 赵金. 西北农林科技大学, 2021
- [4]MiR-99a调控猪颗粒细胞增殖凋亡的作用机制研究[D]. 侯晗琦. 广西大学, 2021(12)
- [5]miR-184调控猪卵巢颗粒细胞雌二醇合成、增殖和凋亡的作用研究[D]. 时胜洁. 西北农林科技大学, 2021
- [6]低温导致四川华鳊卵泡闭锁的机制研究[D]. 刘楠楠. 西南大学, 2021(01)
- [7]Sohlh1基因敲除小鼠卵泡闭锁异常及其机制的研究[D]. 杜冰. 中国医科大学, 2021
- [8]热应激影响蛋鸡等级前卵泡发育的机理研究[D]. 李桂明. 山东农业大学, 2020
- [9]绵羊卵泡颗粒细胞中POSTN基因的表达调控及功能研究[D]. 刘春洁. 内蒙古农业大学, 2020(06)
- [10]TIPE1表达促凋亡机制对卵巢癌和颗粒细胞的影响[D]. 李婷婷. 南方医科大学, 2020(06)