一、1G和模拟微重力下前列腺癌细胞PC-3对小鼠成骨样细胞MC3T3-E1增殖和活性的影响（论文文献综述）
艾亮[1]（2020）在《仙灵骨葆胶囊通过miR-100-5p/JMJD3/RUNX2促进成骨细胞分化的研究》文中研究说明目的:1.在临床样本中,明确骨组织中JMJD3的表达与骨质疏松以及成骨关键因子RUNX2表达的相关性。2.在细胞研究中,明确仙灵骨葆是否通过激活JMJD3/RUNX2促进成骨细胞的分化。3.进一步深入探讨仙灵骨葆调控JMJD3/RUNX2途径的分子机制。方法:1.临床研究（1）遵循严格的纳入标准和排除标准,选取50-70岁因髋关节骨性关节炎拟行全髋关节置换术的绝经后女性患者20例,其中骨质疏松组10例,骨量正常组10例。（2）分别提取骨组织样本RNA和蛋白,q RT-PCR检测骨组织中JMJD3和RUNX2的m RNA表达,WB检测骨组织中JMJD3、H3K27me3和RUNX2的蛋白表达。（3）统计分析骨组织中JMJD3表达水平与研究对象临床特征和RUNX2的表达水平的相关性。2.细胞研究（1）一定浓度的仙灵骨葆处理MC3T3-E1细胞14d,CCK-8检测细胞增值率,Elisa和ALP染色检测成骨标志物ALP的表达和活性,WB检测JMJD3和RUNX2表达水平的变化。（2）设计合成三条针对JMJD3的si RNA序列,转染（NC组,si-JMJD3-1组,si-JMJD3-2组,si-JMJD3-3组）48h后提取细胞RNA,q RT-PCR检测JMJD3的相对水平。（3）根据q RT-PCR结果挑选干扰效率最好的一条si RNA转染仙灵骨葆处理的MC3T3-E1细胞（Mock组,XLGB组,OM组,XLGB+si-NC组,XLGB+si-JMJD3组）,ELISA检测细胞中ALP水平的表达,q RT-PCR和WB分别检测细胞中RUNX2的m RNA和蛋白相对表达水平。3.机制研究（1）利用生物信息学预测mi R-100-5p与JMJD3的靶向结合作用。（2）通过双荧光素酶报告基因系统验证mi R-100-5p与JMJD3的靶向调控作用。（3）合成mi R-100-5p的拟似物转染仙灵骨葆处理的MC3T3-E1,检测成骨标志物ALP的表达以及JMJD3的表达改变。成果:1.临床研究（1）JMJD3在骨质疏松骨组织中的表达水平显着低于骨量正常的骨组织。通过q RT-PCR检测分析发现,骨质疏松组骨组织样本中JMJD3的m RNA表达水平显着低于对照组（P<0.05）,RUNX2的m RNA表达水平同样显着低于对照组骨组织样本中的水平（P<0.01）。通过Western Blot检测分析发现,骨质疏松组骨组织样本中JMJD3的蛋白表达水平显着低于对照组（P<0.05）,RUNX2的蛋白表达水平显着低于对照组骨组织样本中的水平（P<0.05）,而H3K27me3的表达水平显着高于对照组样本（P<0.05）。（2）JMJD3在骨组织中的表达水平与RUNX2表达水平正相关。JMJD3和RUNX2在骨组织中的m RNA表达水平显着正相关（Pearson r=0.8227,R2=0.0.6768,P<0.0001）。（3）JMJD3在骨组织中的表达水平与BMD正相关。JMJD3的m RNA相对表达水平与BMD水平显着正相关（Pearson r=0.7102,R2=0.5044,P<0.001）,RUNX2的m RNA相对表达水平与BMD水平显着正相关（Pearson r=0.7383,R2=0.5451,P<0.001）。2.细胞研究（1）仙灵骨葆在0.125mg/m L-1.0mg/m L浓度下对细胞没有毒性0.125 mg/m L,0.25 mg/m L,0.5 mg/m L,1.0 mg/m L仙灵骨葆胶囊处理从第1天到5天均能促进MC3T3-E1细胞的增殖,特别在浓度为1.0mg/m L时,促进效果最明显（P<0.001）。表明仙灵骨葆在0.125mg/m L-1.0mg/m L浓度下对细胞没有毒性,不会抑制MC3T3-E1细胞的增殖。（2）仙灵骨葆胶囊促进MC3T3-E1分化为成骨细胞。0.125mg/m L仙灵骨葆胶囊（XLGB）处理,能显着诱导成骨标志蛋白ALP的产生。仙灵骨葆胶囊（XLGB）浓度达到0.5mg/m L以后继续增加处理浓度到1mg/m L时增长不再显着增加。且在0.125mg/m L仙灵骨葆处理下对ALP的表达水平已经达到了成骨诱导液（OM）作用下ALP的表达水平。碱性磷酸酶染色结果显示细胞中ALP染色信号强度在仙灵骨葆（XLGB）浓度达到0.25mg/m L时,与对组处理组相比,ALP染色信号平均光密度值出现显着增加（P<0.05）。随着仙灵骨葆（XLGB）浓度的增加,ALP染色信号强度持续增加。（3）仙灵骨葆胶囊促进JMJD3/RUNX2通路激活。通过q RT-PCR和WB检测发现,仙灵骨葆处理组细胞对比对照组MC3T3-E1细胞JMJD3的m RNA表达水平显着增加（P<0.05）,RUNX2的m RNA表达水平显着增加（P<0.001）,JMJD3的蛋白表达水平显着增加（P<0.001）,RUNX2的蛋白表达水平显着增加（P<0.001）。（4）抑制JMJD3/RUNX2通路可以缓解仙灵骨葆胶囊对成骨细胞分化的促进作用。仙灵骨葆处理组（XLGB）和成骨诱导液处理组（OM）的细胞中ALP的表达水平比空白对照组有显着升高（P<0.001）,XLGB处理组和XLGB+si-NC处理组细胞中ALP的表达水平无显着差异,而XLGB+si-JMJD3处理组细胞中ALP的表达水平比XLGB组以及XLGB+si-NC组均有显着下调（P<0.01）。仙灵骨葆处理组（XLGB）和成骨诱导液处理组（OM）的细胞中RUNX2的m RNA表达水平和蛋白表达水平均比空白对照组细胞有显着升高（P<0.05）,XLGB处理组和XLGB+si-NC处理组细胞中RUNX2的m RNA表达水平和蛋白表达水平均无显着差异,而XLGB+si-JMJD3处理组细胞中RUNX2的m RNA表达水平和蛋白表达水平均比XLGB组以及XLGB+si-NC组有显着下调（P<0.05）。3.机制研究（1）仙灵骨葆胶囊抑制MC3T3-E1细胞中mi R-100-5p的表达。Target Scan预测发现,mi R-100-5p能与JMJD3的3’UTR区域结合。仙灵骨葆处理组（XLGB）MC3T3-E1细胞中mi R-100-5p的相对表达水平显着低于空白对照组（Mock）,降低到了大概五分之一（P<0.0001）。而仙灵骨葆处理组（XLGB）对比成骨诱导液处理组（OM）MC3T3-E1细胞中mi R-100-5p的表达水平要高（P<0.0001）。（2）荧光素酶报告基因系统检测mi R-100-5p与JMJD3的结合。与联合转染mi R-100-5p拟似物阴性序列与带野生型JMJD3m RNA 3’UTR（JMJD3-WT）的荧光素酶报告质粒相对比,联合转染mi R-100-5p拟似物与带JMJD3m RNA 3’UTR的荧光素酶报告质粒组检测到的荧光素酶活性显着降低（P<0.001）。而联合转染mi R-100-5p拟似物阴性序列与带突变型JMJD3m RNA3’UTR（JMJD3-mut）的荧光素酶报告质粒细胞中对比联合转染mi R-100-5p拟似物与带突变型JMJD3m RNA 3’UTR（JMJD3-mut）的荧光素酶报告质粒细胞,检测到的荧光素酶活性无显着差异。（3）转染mi R-100-5p拟似物可缓解仙灵骨葆胶囊对JMJD3表达的促进作用。仙灵骨葆组（XLGB）比空白对照组（Mock）细胞中JMJD3的相对水平有显着增加（P<0.01）。成骨诱导液组（OM）对比仙灵骨葆组（XLGB）细胞中JMJD3的相对表达水平无显着差异。仙灵骨葆组联合mi RNA阴性对照组（XLGB+mimic-NC）对比比仙灵骨葆组（XLGB）细胞中JMJD3的相对表达水平无显着差异。而XLGB处理基础上转染mi R-100-5p拟似物（XLGB+mi R-100-5p）的MC3T3-E1细胞中JMJD3的表达水平比转染mi RNA阴性对照拟似物的MC3T3-E1细胞（XLGB+mimic-NC组）有显着降低（P<0.001）。（4）转染mi R-100-5p拟似物可缓解仙灵骨葆胶囊对成骨细胞分化的促进作用。仙灵骨葆胶囊处理组（XLGB）比空白对照组（Mock）细胞中ALP的表达水平有显着增加（P<0.01）;成骨诱导液组（OM）对比仙灵骨葆组（XLGB）细胞中ALP的表达水平无显着差异;仙灵骨葆组联合mi RNA阴性对照组（XLGB+mimic-NC）对比比仙灵骨葆组（XLGB）细胞中ALP的表达水平无显着差异;XLGB处理基础上转染mi R-100-5p拟似物（XLGB+mi R-100-5p）的MC3T3-E1细胞中ALP的表达水平比转染mi RNA阴性对照拟似物的MC3T3-E1细胞（XLGB+mimic-NC组）有显着降低（P<0.01）。结论:（1）临床研究表明,骨质疏松患者骨组织中JMJD3的表达显着低于骨质正常人群,且JMJD3的表达水平与成骨分化关键因子RUNX2和BMD成正相关。说明JMJD3可能通过RUNX2调节了骨形成参与了骨质疏松的发生发展。（2）在体外细胞研究中,本研究首先明确了仙灵骨葆对成骨细胞分化的促进作用以及对JMJD3/RUNX2通路的激活作用,并且以成骨诱导培养基促进效果进行了对比,0.125mg/m L的仙灵骨葆即可达到成骨诱导培养基对成骨细胞分化的促进作用。同时,我们利用基因干扰技术在仙灵骨葆处理的前成骨细胞MC3T3-E1中转染JMJD3的有效si RNA序列,发现JMJD3-si RNA可以显着抑制仙灵骨葆对MC3T3-E1细胞成骨分化的促进作用。说明仙灵骨葆胶囊可能通过激活JMJD3/RUNX2途径促进成骨细胞分化。（3）机制研究中,本研究利用生物信息学软件预测发现,在骨质疏松患者外周血中高表达的mi R-100-5p与JMJD3m RNA的3’UTR具有靶向结合位点。通过细胞实验表明仙灵骨葆胶囊和成骨诱导液处理均可以显着抑制mi R-100-5p在MC3T3-E1中的表达。通过双荧光素酶报告基因系统发现mi R-100-5p过表达能抑制JMJD3的表达,当突变掉JMJD3 m RNA 3’UTR上与mi R-100-5p结合的位点后,mi R-100-5p不再抑制JMJD3表达。同时转染mi R-100-5p拟似物能抑制仙灵骨葆胶囊对MC3T3-E1成骨分化的促进作用。综上所述,仙灵骨葆胶囊可通过抑制mi R-100-5p的表达促进JMJD3/RUNX2通路的激活促进骨形成从而发挥治疗骨质疏松症的作用。
朱云森[2]（2020）在《骨粘连蛋白通过p38MAPK通路调控成骨细胞矿化的研究》文中认为背景和目的:正常的骨基质矿化是骨形成和骨修复重建的关键步骤;成骨细胞分泌的I型胶原组成基质的主要成分并提供矿化的基础框架结构,而非胶原蛋白参与并调控羟基磷灰石的有序沉积。骨粘连蛋白（osteonectin,ON）是一种重要的非胶原蛋白,又称为SPARC或BM-40,它对1型胶原和羟基磷灰石有高度的亲和力,参与了细胞外基质矿化的始末过程;同时作为重要的细胞外基质功能调节蛋白,骨粘连蛋白调节细胞外基质和胶原的合成,影响成骨细胞数量和功能,对矿化起重要的调控作用。P38 MAPK是丝裂原活化蛋白激酶,是细胞外信号向细胞内传导的重要通路,也是骨形成的重要信号枢纽,在不同的成骨信号的作用下,p38MAPK可以调节成骨细胞碱性磷酸酶的活性和矿化能力。既往骨粘连蛋白在矿化中的研究多集中于基因敲除的动物实验,本课题的目点是为骨粘连蛋白调控成骨细胞矿化提供直接的实验依据,同时对p38 MAPK是否是其重要的信号传导途径进行实验研究,为有效干预骨基质矿化提供更多的作用位点。研究方法:第一部分:成骨细胞分离、培养与鉴定取新生SD乳鼠（出生48h内）的颅盖骨,采用酶交替消化法进行成骨细胞分离,利用差异贴壁法进行纯化,获得的成骨细胞使用碱性磷酸酶染色进行阳性率测定,茜素红染色检测矿化结节形成。第二部分:不同浓度的骨粘连蛋白对成骨细胞矿化期OCN、OPN、BSP及p38 MAPK基因表达的影响研究分离培养获得的传代成骨细胞进行随机分组,分别加入不同浓度的大鼠重组骨粘连蛋白（SPARC/BM-40）:A组,空白对照组,不添加骨粘连蛋白;B组,0.01μg/ml骨粘连蛋白;C组,0.1μg/ml骨粘连蛋白;D组,1μg/ml骨粘连蛋白;E组,10μg/ml骨粘连蛋白;在第2、5及8d分别取材并提取各组RNA,通过RT-qPCR检测骨钙素（OCN）、骨桥蛋白（OPN）、骨涎蛋白（BSP）及p38 MAPK的基因表达,明确骨粘连蛋白在成骨细胞矿化中的调控作用,并根据实验结果确定实验的最佳适宜浓度（骨粘连蛋白OPTIMA）及取材观察时间。第三部分:骨粘连蛋白对成骨细胞其它矿化指标的影响及SB203580（p38MAPK特异性阻断剂）的阻断效应研究根据第二部分实验结果,我们对骨粘连蛋白在成骨细胞中的正向调控作用进行进一步证实,同时对p38的具体作用进行研究,实验进行重新分组:空白对照组,不添加骨粘连蛋白;骨粘连蛋白OPTIMA组,添加骨粘连蛋白OPTIMA;p38阻断剂组,预先在成骨细胞内加入20.0μmol/l的SB203580（p38 MAPK特异性阻断剂）培养2h,再添加骨粘连蛋白OPTIMA;实验增加了小整合素结合配体N-连接糖蛋白家族:细胞外基质磷酸糖蛋白（MEPE）、牙本质基质蛋白1（DMP1）和牙本质涎磷蛋白（DSPP）基因表达的RT-qPCR检测;同时利用流式细胞仪对成骨细胞内钙离子浓度进行了测定;茜素红染色检测矿化结节及电镜下观察成骨细胞的超微结构;Western-blot测定各组p38 MAPK及磷酸化p38 MAPK（P-p38）的蛋白表达。第四部分:P38 MAPK重组腺病毒载体及p38 MAPK-shRNA慢病毒载体的构建P38MAPK重组腺病毒载体（AD-p38）的构建:根据基因库序列,设计p38MAPK引物,加入酶切位点,以大鼠心脏cDNA为模板进行PCR扩增,经过测序鉴定后,将目的基因片段连入pShuttle-CMV的相应酶切位点,构建重组腺病毒穿梭质粒,酶切线性化处理后将其与AdEasyTM DNA共转化BJ5183感受态菌,抽提重组AdEasyTM质粒制备Ad-p38MAPK DNA转染细胞。P38MAPK-shRNA慢病毒载体的构建:根据p38MAPK基因序列,由公司合成提供3条干扰靶点序列shRNA1、shRNA2、shRNA3及非特异性靶序列,经酶切线性化处理后,通过连结慢病毒穿梭质粒及辅助包装共转染细胞,进行病毒滴度测定,通过效应蛋白表达检测选择干扰程度最大的用于后续试验。第五部分:P38信号通路在骨粘连蛋白调控成骨细胞矿化中的作用的进一步研究为了进一步探讨p38 MAPK在骨粘连蛋白调控成骨细胞矿化中的信号通路作用,我们通过构建的p38 MAPK重组腺病毒载体转染成骨细胞过表达p38及p38-shRNA慢病毒载体转染成骨细胞来抑制表达p38,并进行实验分组:对照组,仅添加骨粘连蛋白OPTIMA;AD-p38 MAPK组:成骨细胞被AD-p38 MAPK转染再添加骨粘连蛋白OPTIMA;p38阻断剂组,预先在成骨细胞内加入20.0μmol/l的SB203580（p38 MAPK特异性阻断剂）培养2h再添加骨粘连蛋白OpTIMA;p38 MAPK-shRNA组:成骨细胞被p38 MAPK-shRNA转染再添加骨粘连蛋白OPTIMA;使用RT-qPCR和Western-blot法测定各组OCN、OPN、BSP、DMP1、DSPP、MEPE及p38MAPK基因和蛋白的表达。结果:第一部分:分离培养的成骨细胞通过碱性磷酸酶染色细胞阳性率接近100%,矿化诱导2周后茜素红染色及四环素培养标记的矿化结节观察,结果满意。第二部分:不同浓度的骨粘连蛋白对成骨细胞非胶原蛋白（OCN,OPN,BSP）及p38的基因表达均有不同程度的影响;根据实验结果确定1μg/ml骨粘连蛋白为本组实验最佳效应浓度（骨粘连蛋白OpTIMA）,第5天为实验观察取材时间;1μg/ml的骨粘连蛋白组在第5天能显着提高成骨细胞OCN、OPN、BSP及p38的基因表达,与空白对照组比较差异均有统计学差异（OCN,p<0.01;OPN,p<0.05;BSP,p<0.05;p38,p<0.001）;同时我们得出初步结论,骨粘连蛋白对成骨细胞矿化存在正向调控作用,并对p38 MAPK通路有激活作用。第三部分:实验进一步证实了骨粘连蛋白对成骨细胞矿化中的正向调控作用,p38 MAPK是其重要的信号传导通路。P38 MAPK蛋白测定结果显示骨粘连蛋白OPTIMA组p38及P-p38的蛋白表达均明显增加,与空白对照组比较差异均有统计学意义（p<0.001）;骨粘连蛋白OPTIMA组Sibling家族蛋白（DMP1、DSPP、MEPE）的基因表达与空白对照组比较均有明显提高,差异均有统计学意义（DMP1,p<0.01;DSPP,p<0.01;MEPE,p<0.001）;流式细胞仪进行细胞内钙离子浓度测定显示骨粘连蛋白OPTIMA组与空白对照组比较明显提高,差异有统计学意义（p<0.01）;根据茜素红染色及photoshop成像分析,骨粘连蛋白OPTIMA组与空白对照组比较矿化结节面积明显增多,差异有统计学意义（P<0.05）;电镜下超微结构观察与空白对照组比较,骨粘连蛋白OPTIMA组细胞成骨活性增加,成骨细胞内含有更多的细胞器及富含矿化物的囊泡结构。添加p38阻断剂（SB203580）后与骨粘连蛋白OPTIMA组比较,P-p38的蛋白测定有显着下降（P<0.001）,非胶原蛋白（OCN、OPN、BSP）及Sibling家族蛋白（DMP1、DSPP、MEPE）的基因表达也均有明显下降,差异均有统计学意义,电镜下观察成骨细胞活性较骨粘连蛋白OPTIMA组明显受到抑制。第四部分:P38MAPK重组腺病毒载体构建中的基因片段电泳验证及序列测定结果均与基因库一致;p38MAPK-shRNA慢病毒载体通过干扰预实验选择p38MAPK-shRNA3转染成骨细胞（干预性能与对照组比较:shRNA1、shRNA2,P<0.01;shRNA3,P<0.001）,病毒滴度的测定阳性转染组为1.7×108IU/ml（对照组:2 × 108IU/ml）,符合实验标准。第五部分:实验进一步证实了 p38 MAPK在骨粘连蛋白调控成骨细胞矿化中的重要作用;结果显示AD-p38组明显上调了骨粘连蛋白对成骨细胞矿化的正向调控作用,与对照组（骨粘连蛋白OPTIMA）比较,OCN、OPN、BSP、DMP1、DSPP、MEPE的基因和蛋白表达以及P-p38的蛋白表达均显着升高,两组差异均有统计学意义;而p38-shRNA组及p38阻断剂组明显下调了骨粘连蛋白对成骨细胞矿化的正向调控作用,与对照组（骨粘连蛋白OPTIMA）比较,两组的OCN、OPN、BSP、DMP1、DSPP、MEPE的基因、蛋白表达以及P-p38的蛋白表达均明显下降,差异均有统计学意义。结论:骨粘连蛋白通过p38 MAPK通路调控成骨细胞矿化:①骨粘连蛋白对成骨细胞矿化存在正向调控作用:1μg/ml的骨粘连蛋白能显着提高成骨细胞非胶原蛋白（OCN,OPN,BSP）及Sibling家族蛋白（DMP1、DSPP、MEPE）的基因和蛋白表达,显着提高细胞内钙离子浓度,促进成骨细胞矿化结节的形成和成骨活性。②骨粘连蛋白可以激活p38 MAPK信号通路:1μg/ml的骨粘连蛋白能显着提高成骨细胞p38 MAPK的基因和蛋白表达。③P38MAPK是骨粘连蛋白调控成骨细胞矿化的重要信号通路:p38阻断剂的使用及p38-shRNA病毒载体转染的成骨细胞（p38抑制表达）明显下调骨粘连蛋白对成骨细胞矿化的正向调控作用;AD-p38转染的成骨细胞（p38过表达）上调骨粘连蛋白对成骨细胞矿化的正向调控作用。
吴加东[3]（2020）在《雷帕霉素改善铁蓄积高转换骨质疏松中“骨生成/血管形成”的基础研究》文中研究说明第一部分铁蓄积对小鼠、成骨细胞中mTOR水平及小鼠骨量的影响目的:研究铁蓄积—mTOR表达之间的关系,探索mTOR在铁蓄积骨质疏松中可能存在的作用。方法:1、动物实验:制作外源性铁蓄积小鼠模型,将20只8周龄野生（Wt）雄性小鼠（C57/BL6）随机分为两组,分别腹腔注射枸橼酸铁胺（Wt+FAC组,n=10）和生理盐水（Wt+Saline组,n=10）,FAC和Saline使用均为40mg/kg,每周3次,持续两月;制作内源性铁蓄积小鼠模型,将10只8周龄铁调素敲除（△Hep）的转基因雌性小鼠和10只8周龄野生（Wt）雌性小鼠予以卵巢切除（OVX）,分别为△Hep+OVX组、Wt+OVX组,饲养两月。两月后检测上述小鼠的体重并取血清和骨组织标本。血清铁蛋白（Fer）、mTOR浓度采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测。肝脏和股骨行普鲁士蓝（Perls）铁染色,电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）检测肝铁含量,股骨微型计算机断层扫描（Micro-CT）检测骨量及骨密度（BMD）后用电感耦合等离子体发射质谱仪（ICP-MS）测量骨铁含量。胫骨mTOR基因表达、蛋白表达分别采用定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫印迹实验（Western Blot）检测。2、细胞实验:实验组将h FOB1.19细胞、RAW264.7细胞用含200μM、50μM浓度FAC的培养基进行干预72h（iron组）,对照组用磷酸盐缓冲液（PBS）干预（cont组）。两组细胞培养基中铁离子浓度用ELISA法检测,mTOR基因表达、蛋白表达分别采用RT-PCR、Western Blot检测。结果:1、在体研究:各组小鼠体重无统计学差异（p>0.05）。在外源性FAC干预后,Wt+FAC组较Wt+Saline组,血清Fer浓度、肝铁含量、骨铁含量、肝脏及股骨远端普鲁士蓝铁沉积显着增加（p<0.05）,同时血清mTOR浓度、mTOR在肝脏和胫骨中的基因表达和蛋白表达水平亦显着上升（p<0.05）。在内源性铁调素敲除后,△Hep+OVX组较Wt+OVX组,血清铁蛋白浓度、肝铁含量、骨铁含量、肝脏及股骨远端普鲁士蓝铁沉积显着增加（p<0.05）,同时血清mTOR浓度、mTOR在肝脏和胫骨中的基因表达和蛋白表达水平亦显着上升（p<0.05）,而且骨量、BMD明显减少（p<0.05）。2、离体研究:在外源性FAC干预后,h FOB1.19细胞培养基中铁离子浓度明显增加（p<0.05）,同时mTOR基因表达、蛋白表达均显着上升（p<0.05）。RAW264.7细胞培养基中铁离子浓度较对照组cont组明显增加（p<0.05）,但mTOR基因表达、蛋白表达两组均无显着差异（p>0.05）。结论:mTOR水平伴随铁浓度增加而上升,铁蓄积可能通过增加的mTOR促进OVX小鼠骨量丢失形成“铁蓄积骨质疏松”。第二部分雷帕霉素在铁蓄积高转换骨质疏松中的骨生成作用目的:研究mTOR抑制剂雷帕霉素（Rapa）对铁蓄积高转换骨质疏松中骨生成的影响。方法:1、动物实验:将16只8周龄野生（Wt）雌性小鼠和48只8周龄铁调素敲除（△Hep）的转基因雌性小鼠予以卵巢切除（OVX）,分为四组（Wt+OVX组、△Hep+OVX组、△Hep+OVX+CMC组和△Hep+OVX+Rapa组）。Rapa为腹腔注射,3mg/kg/day,持续两月。CMC为Rapa溶剂,注射剂量及持续时间同Rapa。末次注射结束后四组小鼠处死取血清和骨组织标本。用股骨微型计算机断层扫描（Micro-CT）检测股骨骨量及骨密度（BMD）等参数,扫描电镜（SEM）、H-E染色检测骨量及骨小梁结构,碱性磷酸酶（ALP）染色检测成骨细胞骨形成能力,生物力学实验检测股骨弯曲弹性模量、弯曲能量、最大弯曲应力、弯曲刚性系数,血清成骨指标（ALP、PINP、Ocn）采用ELISA检测,成骨基因（Runx2、SP7、ALP）表达采用RT-PCR检测。2、细胞实验:将h FOB1.19细胞分为四组（cont组、iron组、iron+si-NC组、iron+si-MT组）,cont组作为对照组,iron组用含200μM浓度FAC的培养基进行干预72h,iron+si-MT组和iron+si-NC组为成骨细胞分别行mTOR特异性si RNA转染和空白转染后再用含200μM浓度FAC的培养基进行干预72h。用碱性磷酸酶（ALP）染色检测成骨细胞活性,用茜素红染色（ARS）检测成骨细胞骨矿化能力,成骨基因（Runx2、SP7、ALP）表达采用RT-PCR检测,成骨蛋白（Runx2,Ocn）表达用Western Blot检测。结果:1、在体研究:股骨Micro-CT显示,与Wt+OVX组相比,△Hep+OVX组和△Hep+OVX+CMC组BMD、BV/TV、TB.N、TB.Th、Conn D明显减少,TB.Sp、SMI明显增加,而△Hep+OVX+Rapa组较△Hep+OVX组和△Hep+OVX+CMC组BMD、BV/TV、TB.N、TB.Th、Conn D增加,TB.Sp、SMI减少（p<0.05）。股骨电镜、胫骨HE染色显示,与Wt+OVX组相比,△Hep+OVX组和△Hep+OVX+CMC组骨量及骨小梁明显减少,使用雷帕霉素后骨量及骨小梁明显改善（p<0.05）,胫骨ALP染色亦表明△Hep+OVX组使用雷帕霉素后成骨细胞骨形成明显增加（p<0.05）。生物力学显示,与Wt+OVX组相比,△Hep+OVX组和△Hep+OVX+CMC组弯曲弹性模量、弯曲能量、最大弯曲应力、弯曲刚性系数明显降低,注射雷帕霉素后明显恢复（p<0.05）。与Wt+OVX组相比,△Hep+OVX组和△Hep+OVX+CMC组血清成骨指标（ALP、PINP、Ocn）、骨组织成骨基因（Runx2、SP7、ALP）表达明显减少,雷帕霉素干预后明显增加（p<0.05）。2、离体研究:ALP染色和茜素红染色显示,与cont组相比,iron组和iron+si-NC组的成骨细胞活性及矿化能力明显下降,iron+si-MT组较iron组和iron+si-NC组明显改善（p<0.05）。与cont组相比,iron组和iron+si-NC组的成骨基因（Runx2、SP7、ALP）和成骨蛋白（Runx2,Ocn）表达明显降低,iron+si-MT组较iron组和iron+si-NC组明显恢复（p<0.05）。结论:雷帕霉素在铁蓄积高转换骨质疏松中可以提高骨量及成骨活性,具有改善骨生成作用。第三部分雷帕霉素在铁蓄积高转换骨质疏松中的血管形成作用目的:研究mTOR抑制剂雷帕霉素（Rapa）对铁蓄积高转换骨质疏松中血管形成的影响。方法:1、动物实验:利用实验第二部分Wt+OVX组、△Hep+OVX组、△Hep+OVX+CMC组、△Hep+OVX+Rapa组标本。RT-PCR、Western Blot分别检测骨组织中促血管生成Slit3基因及蛋白表达水平。备用胫骨作冰冻切片,血小板-内皮细胞粘附分子（CD31）抗体、内皮粘蛋白（EMCN）抗体双染,共聚焦显微镜观察H亚型血管数目及分布。2、细胞实验:利用实验第二部分cont组、iron组、iron+si-NC组、iron+si-MT组成骨细胞,将各自培养基分别培养四组相同人脐静脉内皮细胞（HUVEC）。用划痕实验、小管形成实验分别检测HUVEC迁移能力、管形成能力,免疫荧光检测各组HUVEC中EMCN表达情况。结果:1、在体研究:与Wt+OVX组相比,△Hep+OVX组和△Hep+OVX+CMC组Slit3基因表达、蛋白表达、H亚型血管数目及分布明显减少,使用雷帕霉素后明显增加（p<0.05）,但△Hep+OVX组和△Hep+OVX+CMC组无明显差异（p>0.05）。2、离体研究:与cont组培养基培养的HUVEC相比,iron组和iron+si-NC组培养基培养的HUVEC其迁移能力、管形成能力明显抑制,EMCN表达明显减少,iron+si-MT组上述指标明显恢复（p<0.05）。结论:雷帕霉素在铁蓄积高转换骨质疏松中可以促进Slit3基因表达、蛋白表达、增加H亚型血管数目及分布,mTOR抑制后HUVEC活性增强,具有改善血管形成作用。第四部分雷帕霉素改善铁蓄积高转换骨质疏松的机制研究目的:研究雷帕霉素改善铁蓄积高转换骨质疏松的作用机制。方法:1、细胞实验:利用实验第二部分cont组、iron组、iron+si-NC组、iron+si-MT组成骨细胞,将各自培养基分别培养四组相同HUVEC。RT-PCR、Western Blot（或ELISA）检测细胞中mTOR、STAT1、Cxcl9、VEGF、KDR（VEGF受体）、p KDR等相关基因及通路蛋白表达水平。免疫荧光检测成骨细胞和HUVEC中KDR的磷酸化水平。2、动物实验:利用实验第二部分Wt+OVX组、△Hep+OVX组、△Hep+OVX+CMC组、△Hep+OVX+Rapa组标本。RT-PCR、Western Blot检测骨组织中mTOR、STAT1、Cxcl9、VEGF、KDR（VEGF受体）、p KDR等相关基因及通路蛋白表达水平。结果:1、离体研究:h FOB1.19细胞在接受FAC干预后（即iron组）mTOR及其下游STAT1、Cxcl9、VEGF等基因、蛋白表达上升,p KDR表达下降,在mTOR特异性si-RNA转染后（即iron+si-MT组）,上述指标明显恢复（p<0.05）。iron组和iron+si-NC组无明显差异（p>0.05）。2、在体研究:铁调素敲除的转基因去卵巢小鼠（即△Hep+OVX组）较Wt+OVX组,骨组织中mTOR及其下游STAT1、Cxcl9、VEGF等基因、蛋白表达上升,p KDR表达下降,在使用雷帕霉素后（即△Hep+OVX+Rapa组）,上述指标明显恢复（p<0.05）。△Hep+OVX组和△Hep+OVX+CMC组无明显差异（p>0.05）。结论:铁蓄积通过mTOR/STAT1/Cxcl9通路,抑制p KDR,使VEGF及KDR有效结合减少,从而影响高转换骨质疏松骨量恢复。雷帕霉素可以靶向mTOR,改善“骨生成/血管形成”,具有成骨作用。
高丹丹[4]（2020）在《HIF-1α在低氧诱导的成骨细胞RANKL表达中作用及低氧下红景天苷对破骨细胞HIF-1α通路调控作用的研究》文中进行了进一步梳理骨重建的失衡是由于成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞介导的骨吸收之间的偶联被破坏,容易引起各类骨代谢异常疾病。越来越多的研究表明,低氧与骨质疏松的发生密切相关。我国有相当大一部分人居住在高原慢性低氧环境中,因此,研究低氧对骨代谢的影响有非常重要的意义。低氧是骨代谢的重要调节因子,HIF-1是诱导低氧基因和修复细胞内微环境的核心转录因子,能激活下游靶基因的转录,引发细胞对缺氧的一系列适应性反应。已证实,缺氧可导致HIF-1α大量聚集,进而激活破骨细胞活性,促进破骨细胞分化并增加骨吸收活性。RANKL是调节破骨细胞分化和功能的关键因素,由成骨细胞分泌,低氧或内源性过表达HIF-1α可促进RANKL的表达,与破骨细胞表面的RANK受体结合后,可诱导破骨细胞分化。红景天苷（Salidroside,SAL）是红景天中的主要活性成分,具有抗缺氧、抗癌、抗抑郁、保护中枢神经系统、保护心血管系统等药理活性。课题组前期工作证实,SAL在低氧条件下可通过激活成骨细胞HIF-1α/VEGF通路介导血管生成骨形成偶联,提高去卵巢大鼠的骨密度、骨生物力学及形态计量学指标。有关氧感应成骨细胞HIF-1α能否通过直接上调自身RANKL表达间接促进破骨细胞分化和功能,以及SAL对破骨细胞的作用是否也通过激活氧感应HIF-1信号通路影响破骨细胞的分化和功能,均未见报道。本研究在文献报道及前期工作基础上,利用小鼠破骨前体RAW264.7细胞、小鼠骨髓破骨前体细胞（BMMs）、人成骨样MG-63细胞、小鼠成骨样MC3T3-E1细胞模型,从细胞及分子水平研究HIF-1α对低氧诱导的成骨细胞RANKL表达中作用,及低氧下SAL对破骨细胞HIF-1α通路调控作用,为今后临床应用SAL防治骨质疏松症提供依据。方法:1选择人成骨样MG-63细胞和小鼠成骨样MC3T3-E1细胞作为研究模型,采用低氧（1%O2）和模拟低氧（CoCl2）两种方式处理细胞,实验分为三组:（1）对照组;（2）1%O2组;（3）CoCl2组（500μM）,运用q PCR和ELISA实验技术检测低氧对MG-63细胞和MC3T3-E1细胞RANKL基因和蛋白表达的影响。进一步应用HIF-1α抑制剂YC-1证实低氧对RANKL表达的上述作用是HIF-1α介导的,方法同上,不同之处在于低氧前先用YC-1（10μM）或DMSO预处理细胞1 h,同时设立YC-1对照组。2运用脂质体瞬时转染技术,将ss HIF-1α及其空载体p CMVh-HA或HIF-1αsh RNA及scramble sh RNA分别导入成骨细胞中,利用Western Blot、ELISA、q PCR技术检测内源性过表达和抑表达HIF-1α对成骨细胞RANKL基因和蛋白表达的影响。3运用脂质体法将pGL3-h RANKL promoter-luc质粒与ss HIF-1α或p CMVh-HA及SV40-βgal共转染至成骨细胞中,24 h后低氧作用24 h,应用荧光素酶报告基因技术检测HIF-1α对成骨细胞RANKL转录活性的影响。4运用ChIP技术确定低氧条件下HIF-1α能否与成骨细胞染色质中的RANKL启动基因结合。5利用CoCl2低氧条件,实验分为六组:（1）对照组;（2）CoCl2组（100μM）;（3）CoCl2+SAL（1 n M）组;（4）CoCl2+SAL（10 n M）组;（5）CoCl2+SAL（100 n M）组;（6）CoCl2+SAL（1000 n M）组;运用Western Blot、ELISA、q PCR技术,检测低氧下SAL对破骨前体细胞RAW264.7中HIF-1α、p VHL、VEGF、ANGPTL4、IL-6和mi R-20a基因和蛋白表达的影响。6利用RANKL（50 ng/m L）和M-CSF（25 ng/m L）诱导RAW264.7细胞4天,将其诱导为成熟的破骨细胞,利用TRAP染色鉴定;运用同5中的条件和方法,检测低氧下SAL对经RANKL和M-CSF诱导的成熟破骨细胞RAW264.7中HIF-1α、p VHL、VEGF、ANGPTL4、IL-6和mi R-20a基因和蛋白表达的影响。7选用4～6周龄雄性C57BL/6小鼠,无菌条件下取双侧股骨骨髓,提取BMMs细胞,利用TRAP染色、细胞表面抗体检测鉴定原代破骨细胞的纯度;利用MTT与Western Blot技术,摸索相当于1%O2时的CoCl2浓度;并利用RANKL（50 ng/m L）和M-CSF（50 ng/m L）诱导原代破骨前体细胞4天,将其诱导为成熟的破骨细胞,运用同5中的条件和方法,检测低氧下SAL对BMMs细胞中HIF-1α、p VHL、VEGF、ANGPTL4、IL-6和mi R-20a基因和蛋白表达的影响。8采用免疫荧光和Western Blot技术观察低氧下SAL对RAW264.7细胞中HIF-1α核转位的影响,以及脂质体瞬时转染技术,将mouse p GL3-4×HRE-luc质粒导入RAW264.7细胞中,运用荧光素酶报告基因技术检测低氧下SAL对RAW264.7细胞中HIF-1α转录活性的影响。9运用YC-1（10μM）对上述实验进行阻断,选取SAL作用最明显的浓度,实验分为五组:（1）对照组;（2）YC-1组;（3）CoCl2组（100μM）;（4）CoCl2+SAL组;（5）YC-1+CoCl2+SAL组;探讨低氧下YC-1对SAL介导的RAW264.7细胞中HIF-1α、p VHL、VEGF、ANGPTL4、IL-6和mi R-20a基因和蛋白表达以及HIF-1α核转位和转录活性的影响。结果:1低氧（1%O2）或模拟低氧（500μM CoCl2）条件下,可使人成骨样MG-63细胞和小鼠成骨样MC3T3-E1细胞RANKL基因和蛋白表达水平显着升高,应用HIF-1α特异性阻断剂YC-1可阻断低氧对RANKL表达的调节作用。2内源性过表达HIF-1α可上调MG-63细胞RANKL基因和蛋白的表达,而抑制内源性HIF-1α表达则可下调RANKL基因和蛋白表达,提示低氧条件下氧感应成骨细胞也可能通过诱导HIF-1α直接上调自身RANKL表达从而间接促进破骨细胞分化。3低氧条件下,过表达HIF-1α可显着上调MG-63细胞RANKL基因启动子的转录活性。4低氧能促进HIF-1α与MG-63细胞染色质中的RANKL启动基因结合。5低氧条件下SAL对破骨前体细胞RAW264.7中HIF-1α及其下游靶基因VEGF、ANGPTL4和IL-6基因和蛋白的表达起促进作用,而抑制下游靶基因mi R-20a及上游调控基因p VHL的表达。6经TRAP检测,经RANKL和M-CSF诱导的RAW264.7细胞,分化为成熟的破骨细胞;低氧条件下SAL可促进经RANKL和M-CSF诱导的成熟破骨细胞RAW264.7中HIF-1α及其下游靶基因VEGF、ANGPTL4和IL-6基因和蛋白的表达,而抑制下游靶基因mi R-20a及上游调控基因p VHL的表达。7经表面抗体的荧光检测、TRAP鉴定,证明所提取小鼠骨髓细胞为原代破骨前体细胞,纯度为97.9%;利用MTT与Western Blot技术,摸索出相当于1%O2时的CoCl2浓度为50μM;低氧条件下SAL可促进BMMs细胞中HIF-1α及其下游靶基因VEGF、ANGPTL4和IL-6基因和蛋白的表达,而抑制下游靶基因mi R-20a及上游调控基因p VHL的表达。与RAW264.7细胞的结果一致。8低氧条件下SAL可促进RAW264.7细胞中HIF-1α的核转位,胞浆胞核中HIF-1α的蛋白量均增加,其中胞核中的蛋白表达量显着升高;另外,低氧条件下SAL对HIF-1α的转录活性也具有促进作用。9应用HIF-1α特异性阻断剂YC-1能明显抑制低氧条件下SAL介导的HIF-1α及其下游靶基因VEGF、ANGPTL4和IL-6基因和蛋白的表达,并促进下游靶基因mi R-20a及上游调控基因p VHL的表达;对低氧条件下SAL介导的HIF-1α的核转位和转录活性也具有抑制作用。结论:1 HIF-1α表达可上调成骨细胞RANKL的表达,HIF-1α是通过与RANKL分子的基因启动子结合来促进其转录进而上调其表达的。2低氧条件下,SAL可促进破骨细胞内HIF-1α信号通路中下游靶基因VEGF、ANGPTL4和IL-6的表达,抑制下游靶基因mi R-20a及上游调控基因p VHL的表达。3低氧条件下,SAL通过促进破骨细胞内HIF-1α的核转位及其转录活性,促进HIF-1α的表达。
韦淑萍[5]（2019）在《高重力对成骨细胞与骨重建的影响及其机理研究》文中研究表明研究背景和目的:力学刺激同生物化学刺激均在细胞内触发各种胞内信号。目前,力学生物学成为研究流体静水压、压缩应力和拉伸应力等力学刺激对生物体影响的重要手段之一。力学刺激在骨重塑中起着重要作用。骨组织细胞在体内的应力作用下分化、增殖并成熟,并对应力刺激极为敏感。体外培养的工程骨组织往往不能提供足够的组织结构和力学性能,这在很大程度上归因于细胞培养过程中缺乏力学载荷的刺激。近几十年来,我国在航空航天领域取得了巨大的成就,空间探索、科研活动、飞行训练活动日益频繁,重力场（微重力、超重）的改变对骨组织代谢影响的研究也越来越受到关注。由于细胞质和细胞内的细胞器,如细胞核、线粒体、细胞骨架（包括肌动蛋白纤维、中间丝和微管）等均有不同的密度,重力的改变可引起它们相对位置的改变。研究表明,重力场的变化对细胞的结构和功能均产生各种影响。一般来说,微重力的暴露可抑制骨质的生成。虽然超重可以通过体外高速离心的方式实现,但目前为止,关于高重力（高G）环境对骨组织细胞影响的相关研究却相当有限。最新的研究表明,超重可触发复杂的力学传导途径,在转录水平和转录后水平发生重要的调节作用。然而,超重对成骨细胞影响的确切力学生物学机制还有待深入研究。本文主要采用力学生物学方法探讨高重力（超重）的极端力学环境下成骨细胞如何响应,分子水平如何变化,成骨细胞损伤、重建的过程和机理如何,为极端力学环境下骨组织细胞的生长、分化、重建和适应性变化的研究提供理论基础。该研究是对生理载荷环境下骨组织/细胞的生长、分化、重建和适应性变化研究工作的延伸,从而发展生物力学和力学生物学的新理论、新方法和新技术,拓展生物力学研究的新领域。研究方法:1高加速度离心式加载装置构建小鼠MC3T3-E1细胞高重力模型,加速度分别为1 g、5 g、10 g、20 g、40 g,1天1次,每次30 min,共3天;2小鼠MC3T3-E1细胞经高重力暴露后,应用HE染色、透射电镜及鬼笔环肽染色分别观察MC3T3-E1细胞形态、超微结构及细胞微丝骨架的变化;3小鼠MC3T3-E1细胞经高重力暴露后,应用Edu细胞增殖实验、Annexin V-FITC/PI流式细胞术分别检测高重力对MC3T3-E1细胞增殖和凋亡的影响;qPCR及western blot检测高重力对小鼠MC3T3-E1细胞成骨相关基因及蛋白的表达及活性的影响;4采用小鼠lncRNA表达谱及mRNA表达谱芯片筛选差异表达基因及共同差异LncRNA及mRNA表达基因,构建高重力环境下影响成骨细胞基因表达调控图,筛选最相关的信号通路和信号分子,进一步研究候选基因的功能及其调控机制;5运用串联质谱标签（Tandem Mass Tag,TMT）标记的蛋白组学定量技术、联合高效液相色谱串联质谱（High performance liquid chromatography-tandemmass spectrometry,HPLC-MS/MS）分析,研究高重力加载前后MC3T3-E1细胞蛋白质表达谱的变化,筛选差异表达的蛋白,力学生物学及分子生物学方法进一步研究重点蛋白质的功能;多组学联合关联分析转录、翻译、表达等多方面信息,深入探讨高重力在骨重建中的作用及其作用机制。结果:1小鼠MC3T3-E1细胞在正常1 g环境下,培养早期,细胞以梭形为主,细胞突起明显,细胞与细胞之间通过突起相连接,主要呈现成纤维细胞类型;培育晚期,细胞以立方形为主,细胞与细胞之间连接成片,排列成铺路石状,主要呈现上皮细胞类型。小鼠MC3T3-E1细胞在高重力环境下,随着重力加速度的不断增加（5 g、10 g、20 g、40 g）以及培养时间的逐渐增长（24 h、48 h、72 h）,小鼠MC3T3-E1细胞轮廓逐渐变圆;细胞内部微丝肌动蛋白纤维增粗,细胞体积增大,轮廓变圆,与光镜下结果一致;细胞膜、细胞质、细胞核及其线粒体、内质网、核糖体等细胞超微结构均发生改变。2高重力的极端力学环境下,小鼠MC3T3-E1细胞的生物学功能发生改变。低水平（5 g）的高重力暴露,小鼠MC3T3-E1细胞增殖活性开始升高;中水平（10g和20 g）的高重力暴露,成骨细胞增殖活性显着升高;高水平的（40 g）高重力暴露,成骨细胞的增殖活性则受到抑制。低水平（5 g）的高重力刺激对成骨细胞凋亡无明显作用;中水平（10 g和20 g）的高重力刺激可引起成骨细胞轻度凋亡;高水平（40 g）的高重力刺激,对成骨细胞造成损害,引起成骨细胞的大量凋亡。低、中水平（5 g、10 g和20 g）的高重力刺激均能促进小鼠成骨基因（Runx2、ALP和OCN）mRNA和蛋白的表达,其中,当重力加速度为10 g和20 g时,促分化作用最为明显。高水平（40 g）的高重力刺激下,小鼠成骨基因（Runx2、ALP和OCN）mRNA和蛋白的表达下降。3芯片共检测了58,809小鼠lncRNAs和39,027小鼠mRNAs,超重环境下,大量的lncRNA和mRNA均发生改变,且随着重力加速度的增加,差异表达的lncRNA和mRNA也越来越多。在低（5 g）、中（10 g和20 g）、高（40 g）水平高重力暴露下,共差异表达的lncRNAs有193个,mRNAs有35个,其中上调的有28个lncRNAs和6个mRNAs,下调的有165个lncRNAs和29个mRNAs。通过生物信息学分析了潜在的调控机制并进一步预测了差异表达的lncRNAs和mRNAs之间的相互作用关系,通过mRNAs-lncRNAs共表达网络分析鉴定了超重环境中参与骨重建的核心调控因子。结合表达谱芯片检测以及生物信息学分析结果,将lncRNA NONMMUT012703确定为高重力敏感、骨重建相关的lncRNA目标分子进行功能学研究。4通过TMT相对定量的蛋白质组学研究,发现超重环境下,大量蛋白发生变化。随着重力加速度的增加,差异表达的蛋白也越来越多。在低（5 g）、中（10 g和20 g）、高（40 g）水平高重力暴露下,共差异表达的蛋白有24个,其中上调的有22个,下调的有2个。通过生物信息学分析了潜在的调控机制并预测了差异表达蛋白之间的互作关系,进一步研究重点蛋白质的功能。5针对非编码RNA（lncRNAs）表达谱、编码RNA（mRNAs）表达谱和蛋白表达谱,多组学联合关联分析转录、翻译、表达等多方面信息,深入探讨高重力在骨重建中的作用及其机制。生物信息学及后续的相关研究结果预测,NONMMUT012703作为高重力敏感、骨重建相关的候选lncRNA,可能与靶基因（如CFTR,NFATC2,SYCN,SOCS3,GIP,SNHG7OS和VMN2R90）相互作用,或与转录因子（c-Rel、HNF-3beta、E47、HLF、RFX1和COMP1）结合,通过多条信号通路（如MAPK、Jak-STAT、cGMP-PKG、Wnt、PI3K-Ak和VEGF信号通路等）之间的串话作用,共同参与超重环境下的骨重建过程。结论:1课题组自主研发的高加速度离心式加载装置可良好的模拟超重环境,适用于超重环境下细胞力学生物学效应的研究。2小鼠MC3T3-E1细胞具有成骨细胞的生物学特性,力学刺激下具有良好的生物学响应,是研究力学作用下成骨细胞生物学效应的良好模型。3成骨细胞在高重力环境下,为对抗力学刺激,细胞形态、微丝骨架及超微结构均发生改变。4高重力的极端力学环境对成骨细胞的生物学功能产生很大的影响。超重对成骨细胞增殖、凋亡和分化的影响取决于重力加速度的大小。重力加速度20 g以下为细胞安全加载范围,不会引起成骨细胞的大量凋亡。中水平（10 g和20 g）的高G刺激,小鼠成骨细胞生物学行为变化最为显着。5高重力的极端力学环境下,小鼠MC3T3-E1细胞的非编码RNA（lncRNAs）谱、编码RNA（mRNAs）谱及蛋白的表达谱均发生改变,且随着重力加速度的增加,差异变化的基因和蛋白也逐渐增多。6重力场变化情况下获得的在成骨分化过程中具有差异表达的lncRNA可能是骨组织损伤、修复与重建过程中的潜在靶标。7成骨细胞受到超重暴露后差异表达的蛋白可能是重力敏感、骨重建相关的生物标志蛋白。
韩标[6]（2019）在《微重力环境对成骨细胞的影响及机制的实验研究》文中认为背景:近几十年来,我国在航空航天领域取得了巨大的成就,据报道2020年我国将进入载人空间站阶段,航天员在空间站驻留可达一年以上。但是,航天员长时间的微重力暴露后造成骨组织大量流失,回到地球后永久不能恢复到正常水平、易发生骨质疏松是制约宇航员太空作业的主要因素。我们知道,骨组织在正常生理情况下会处于一个动态平衡状态,但是,当骨组织所处的力学环境改变时,如失重或超重,会打破现有的平衡状态,导致骨组织的的代谢异常,以及相关疾病的发生。传统的治疗方案主要抑制骨吸收过程,并不能有效解决骨丢失问题,因此,寻找新的替代疗法是十分必要的。目的:探讨微重力下非编码RNA的差异性变化,将骨质疏松防治从传统层面拓展到基因调控层面;对微重力下骨组织损伤、修复及重建机制的全面系统研究;为航天员太空探索导致骨质疏松的防治提供新的思路与策略。方法:（1）.分别采用细胞旋转培养系统（RCCS）和尾悬吊（Tail suspension）饲养的方法对小鼠MC3T3-E1成骨细胞及C57BL/6J小鼠建立地基微重力环境,经Edu染色与MTT比色法检测成骨细胞在实验前后的增殖情况,RT-PCR与western blot检测成骨分化相关基因蛋白表达变化,观察实验前后成骨细胞分化情况;micro-CT扫描与三点弯曲力学实验检测小鼠实验前后胫骨组织微观结构与力学性能差异,组织形态学观察小鼠骨组织变化情况。（2）.采用转录组测序技术（RNA-seq）寻找微重力环境与正常环境培养3 d后的MC3T3-E1成骨细胞的差异LncRNA、miRNA、CircRNA、mRNA,应用生物信息学方法构建LncRNA-mRNA、miRNA-mRNA、CircRNA-mRNA、LncRNAmiRNA-mRNA和CircRNA-miRNA-mRNA的共表达网络,并对差异LncRNA、miRNA、CircRNA的靶基因mRNA进行聚类和分析,找到与微重力环境下成骨细胞分化相关的LncRNA、miRNA与CircRNA进行分析;并对相关LncRNA、CircRNA的CeRNA进行预测,筛选与成骨分化相关的信号分子和通路,并对相关结果进行验证。（3）.根据（2）的预测结果,选择NF-κB信号通路验证其在微重力环境下对成骨细胞分化的作用,检测NF-κB信号通路中的关键蛋白与基因的表达,并检测培养液与成骨细胞中IL-6的含量与表达情况,初步探讨在微重力环境下NF-κB信号通路对成骨细胞分化的作用。（4）.CKIP-1基因可以通过负调控成骨作用影响骨代谢,通过crisper cas9技术构建MC3T3-E1成骨细胞CKIP-1基因敲除细胞系。结果:（1）.在微重力环境下,动物水平显示小鼠经后肢尾吊4 w后,骨组织微观结构遭到破坏,宏观力学性能下降,承受损伤的能力减弱,主要体现在骨密度、骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁厚度等明显降低以及胫骨的断裂载荷、断裂能量等下降。细胞水平MC3T3-E1成骨细胞的增殖与分化均受到显着抑制,主要体现在细胞增殖速率减低,成骨分化基因表达显着下降。（2）.通过RNA-seq技术成功构建了微重力环境下MC3T3-E1成骨细胞的LncRNA、miRNA及CircRNA的表达谱:细胞在模拟微重力环境前后有1198个lncRNAs、101条miRNA、427条CircRNA以及2538个mRNAs发生显着改变,经共表达分析后并构建互作网络,筛选出9个RNA、5条LncRNA、5条miRNA和3条CircRNA作为后续研究微重力环境对成骨分化作用的目的RNA,同时对LncRNA/CirRNA进行CeRNA预测,找出与成骨分化相关的2个关系对:NONMMUT114186.1-let-7c-5p-Il6ra,circ014154-let-7c-5p-Il6ra,经PCR验证,上述筛选到的目标RNA均与测序结果相同。（3）.经过GO功能注释与KEGG Pathway富集分析后我们发现,参与成骨分化的信号通路涉及到TNF signaling pathway,PI3K-Akt signaling pathway,NF-κB signaling pathway,MAPK signaling pathway等。（4）.在研究NF-κB信号通路在微重力环境下对MC3T3-E1成骨细胞分化的作用之后,在微重力条件下,碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）、一型胶原（CoL-Ⅰ）的基因和蛋白水平表达下调;与此同时,NF-κB信号抑制子α（IκB-α）下调,p65表达显着上调,且二者磷酸化水平升高,细胞培养液中IL-6含量增多。研究表明,微重力环境下NF-κB信号通路激活并调控成骨细胞分化。（5）.成功建立MC3T3-E1成骨细胞CKIP-1敲除杂合子细胞系,CKIP-1在该细胞中表达显着下降（表达量约为对照组的17%）。结论:在微重力环境下,MC3T3-E1成骨细胞的增殖与分化均受到抑制;在成骨细胞生长过程中大量LncRNA、miRNA、CircRNA、mRNA发生差异性改变,说明相关非编码RNA参与了微重力环境下成骨细胞的进程;NONMMUT114186.1—let-7c-5p—Il6ra、circ014154—let-7c-5p—Il6ra可能是微重力环境下调控成骨细胞分化的重要作用方式;微重力环境下通过炎性因子IL-6的增加激活NF-κB信号通路来抑制成骨分化,说明在预防和治疗相关的骨科疾病方面,NF-κB信号通路可能作为一个潜在的靶标;经多次实验,发现crisper cas9技术并不能成功的构建MC3T3-E1成骨细胞CKIP-1敲除完美阳性克隆株,仅能得到CKIP-1杂合克隆株。
杜勇勇[7]（2019）在《模拟失重下破骨源性外泌体中骨形成相关miRNAs的高通量分析研究》文中指出长期空间飞行中,失重性骨质流失已被列为影响航天员生命健康的首要风险因素。失重环境中,航天员体内骨代谢调控的失衡导致了骨质流失的发生。破骨细胞在骨代谢调控中扮演着重要的角色,破骨细胞对成骨细胞的调控机制是骨代谢研究领域的重要研究方向之一。近年来,外泌体已被证实是细胞间通讯的新途径,受到国内外研究者的广泛关注。与此同时,micro RNA（miRNA）作为一种细胞间通讯的信号分子参与了破骨细胞与成骨细胞的相互调节,在此过程中,miRNA分子以外泌体包裹的形式在细胞间传递,直接介导细胞通讯。然而,在失重环境下,由破骨细胞分泌的外泌体对成骨细胞的活性与功能有哪些影响?外泌体中是否包含与成骨细胞骨形成作用相关的miRNAs调控分子?这些miRNAs分子调控骨形成的分子作用机理如何?对于该问题的阐明很可能是解释失重条件下破骨细胞如何调控成骨细胞这一问题的重要突破口之一。因此,本论文从破骨源性外泌体miRNAs入手,采用随机回转仪失重效应模拟设备培养小鼠前破骨样细胞RAW264.7,用RANKL诱导RAW264.7细胞分化形成成熟的破骨细胞并提取其外泌体,研究破骨源性外泌体对成骨细胞的影响,利用高通量测序揭示破骨源性外泌体miRNAs的表达谱,进一步筛选与骨形成相关的miRNAs分子,采用生物信息学分析方法预测候选miRNAs的靶基因,并进行GO功能和KEGG通路富集分析,使用实时荧光定量PCR（RT-q PCR）验证骨形成相关的miRNAs测序结果。实验结果表明:模拟失重实验组（RPM）中RAW264.7细胞的破骨细胞生成活性增强,与正常对照组（CON）相比,RPM组显示出更高的TRAP活性,而CON组的抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）阳性细胞数目、细胞面积和TRAP活性均较低;流式细胞术和Western blot结果均显示破骨源性外泌体高度表达CD63和CD81表面标志物,电镜及粒径检测实验表明外泌体粒径在80 nm左右,且分布均一;通过PKH67染色实验证实MC3T3-E1细胞可以摄取破骨源性外泌体,将外泌体添加到MC3T3-E1细胞培养体系中,通过CCK8法检测到外泌体明显抑制MC3T3-E1细胞的增殖,且呈剂量依赖性;与CON组破骨源性外泌体（OC-Exos-Control）相比,RPM组破骨源性外泌体（RPMOC-Exos）处理MC3T3-E1细胞后其碱性磷酸酶（ALP）活性明显降低,细胞周期被阻滞在G0/G1期,且细胞形成的矿化结节明显减少;此外RPM-OC-Exos可以诱导MC3T3-E1细胞的早期和晚期凋亡并进一步下调了成骨分化相关基因ALP,BSP,OCN,OPN,Col Iα1和Runx2的m RNA表达水平。为了研究破骨源性外泌体在破骨细胞对成骨细胞调控中的重要作用,本论文进一步研究了CON和RPM组破骨源性外泌体miRNAs的表达谱,结果显示,CON和RPM组样本间共有序列占14.6%,分别在CON和RPM组外泌体中鉴定出已知的miRNAs分别有755个和694个,两组中同时鉴定出508个miRNAs;通过小RNA分类注释及序列比对,对已知的miRNAs进行了差异表达分析,绘制了差异表达热图,并对新的miRNAs进行了预测;根据|log2（Fold-change）|≥1并且P value<0.05,筛选出显着性差异表达的116个miRNAs,其中有29个表达上调,87个表达下调。最后,基于构建的破骨源性外泌体miRNAs的表达谱,论文初步筛选了10个骨形成相关差异表达的miRNAs,聚类分析结果显示组内重复性较好,通过Target Scan,mi RDB,mi RTar Base和mi RWalk在线数据库确定了各个miRNAs的候选靶基因;GO功能分析确定了候选靶基因所在的生物过程（Biological process）、细胞组成（Cellular component）和分子功能（Molecular function）;KEGG通路富集到的骨代谢相关信号通路有主要有Wnt,TGF-β,MAPK,Notch和m TOR等;利用RT-q PCR验证骨形成相关的miRNAs,验证结果与miRNAs测序结果高度一致。综上所述,本论文研究了模拟失重下破骨源性外泌体对成骨细胞的影响,并利用高通量测序技术对破骨源性外泌体miRNAs进行测序,构建了破骨源性外泌体miRNAs表达谱,发现116个显着性差异表达的miRNAs,进一步筛选出10个与骨形成相关的候选miRNAs对其进行了靶基因预测及生物信息学分析。本论文研究结果有助于在转录水平认识破骨源性外泌体miRNAs在破骨细胞与成骨细胞通讯中的重要作用,为进一步阐明破骨细胞通过旁分泌机制调节成骨细胞的分子机制以及空间失重性骨质流失的防治提供新的思路和实验依据。
张玲莉[8]（2019）在《跑台运动对生长期小鼠骨髓间充质干细胞BMP-Smad信号通路的影响》文中认为1研究目的通过给雄性生长期小鼠注射激活酶抑制剂后予以跑台运动干预,检测小鼠BMD、生物力学性能参数、在体骨量和骨组织形态学指标、血清尿液中骨代谢相关生物化学指标以及BMP-Smad信号通路上重要基因和蛋白含量;体外实验检测小鼠体内BMSC向成骨细胞分化的程度,无菌处理各组小鼠血清后离体细胞血清饥饿实验。初步揭示BMP-Smad通路介导跑台运动调控BMSC向成骨细胞分化的过程。2研究方法第一部分实验以18只5周龄雄性C57BL/6小鼠作为研究对象,小鼠饲养至7周龄后,按体重随机法分为对照组和运动组,每组各9只。将运动组小鼠于12跑道跑台进行为期5周的跑台运动训练,跑速为18m/min,跑台倾斜5°,每天运动时间50min,每周运动6天,共计5周。处死前8天和前1天在小鼠背部皮下注射Calcein用于对骨骼进行骨荧光标记,于处死当天称重。6只小鼠左侧股骨用于检测骨密度,6只右侧股骨用于BMD、BV/TV检测,3只左侧胫骨用于OCN mRNA和OPN mRNA检测,3只左侧胫骨用于Smad1蛋白激活情况的检测。实验结果皆以均数±标准误表示,所有数据均采用SPSS13.0软件包分析处理。采用独立样本t检验推断组间是否存在差异。P<0.05表示结果有显着性差异。第二部分实验在体动物实验将72只4周龄雄性C57BL/6小鼠饲养至6周龄,麻醉后称重并扫描小鼠全身骨密度,按体重和骨密度随机法分为4组,分别为对照组（C组）、运动组（E组）、LDN组（LDN+C组）、运动+LDN组（LDN+E组）,每组18只。运动训练方案:E组和LND+E组小鼠于12跑道跑台分别进行为期6周中等强度的跑台运动训练,起始跑速为12m/min,持续时间20min,跑台倾斜度均为0°;第一周和第二周隔日跑速增加3m/min,持续时间增加10min;第三周起运动组的跑速为18m/min,运动时间50min,跑台倾斜5°。每周6天。LDN各组小鼠于第三周正式训练前予以腹腔注射ALK2激酶抑制剂（LDN—193189HCL）,注射剂量为3mg/kg,每周一次。处死前8天和前1天在小鼠背部皮下注射Calcein用于对骨骼进行骨荧光标记,前1天禁食6h后采用膀胱按摩法收集小鼠尿液,于-80℃冰箱保存。小鼠于处死当天称重,小鼠血液放置1.5ml EP管中4℃过夜,于次日低温离心提取上清,上清于-80℃冰箱保存。每组3只小鼠两侧股骨和胫骨提取BMSC种于12孔板和10cm规格的培养皿中。10只小鼠左侧股骨用于检测骨密度,其中8只左侧股骨用于骨生物力学性能指标检测;6只右侧股骨用于骨组织形态计量学指标检测。4只小鼠左侧胫骨用于Real-Time PCR检测,其余左侧胫骨用于Western blot检测;3只小鼠右侧胫骨用于micro-CT。离体细胞实验部分离体实验通过CFU形成实验和ALP染色检测了小鼠BMSC向成骨细胞分化的能力以及BMSC中OCN mRNA、Osterix mRNA、Runx2 mRNA、MSX2 mRNA、DLX5mRNA的表达量。无菌处理各组小鼠血清,通过血清饥饿、Western blot检测p-Smad1、Smad1、p-P38、P38、p-ERK、ERK和Actin蛋白含量,检测运动对BMP-Smad信号通路上相关蛋白的激活和表达情况。实验数据均采用SPSS13.0软件包分析处理,论文中表格以均数±标准差表示,图以均数±标准误表示。先采用双因素方差分析,确定跑台运动、抑制剂注射是否产生独立或交互作用,针对不同因素产生的作用,再采用独立样本t检验推断组间是否存在差异。P<0.05表示结果有显着性差异。3研究结果第一部分实验结果（1）运动可以提高小鼠BMD和在体骨量:运动组小鼠股骨BMD、BV/TV均显着高于对照组（P<0.01）。（2）运动可以激活小鼠BMP-Smad信号通路:运动组小鼠胫骨OCN mRNA表达显着高于对照组（P<0.01）,OPN mRNA表达高于对照组（P<0.05）;运动组小鼠胫骨Smad1蛋白激活高于对照组（P<0.05）。第二部分实验结果（1）小鼠运动期间体重变化:结束为期两周的预跑后四组小鼠的体重并未出现显着性差异;正式跑步运动第一周发现LDN+C组小鼠体重显着低于C组小鼠（P<0.01）,LDN+E组小鼠体重显着低于E组小鼠（P<0.01）;第二周的体重趋势和第一周一样;正式跑步运动第三周LDN+C组和C组小鼠体重差异和前两周一致（P<0.01）,LDN+E组小鼠体重低于E组小鼠（P<0.05）;四周跑步运动结束后发现LDN+C组、LDN+E组小鼠体重均显着低于C组和E组小鼠（P<0.01）。（2）小鼠股骨BMD和骨生物力学指标结果:E组小鼠股骨BMD显着高于C组（P<0.01）,LDN+E组小鼠股骨BMD高于LDN+C组（P<0.05）,LDN+C组、LDN+E组小鼠股骨BMD显着低于E组（P<0.01）。股骨生物力学性能指标均未出现显着性变化。（3）小鼠股骨骨组织形态计量学结果:骨荧光结果显示E组和LDN+E组小鼠右侧股骨BV/TV高于LDN+C组小鼠（P<0.05）。E组小鼠右侧股骨Tb.N高于LDN+C组小鼠（P<0.05）,LDN+E组小鼠右侧股骨Tb.N显着高于LDN+C组小鼠（P<0.01）。E组小鼠右侧股骨Tb.Sp低于LDN+C组小鼠（P<0.05）,LDN+E组小鼠右侧股骨Tb.Sp显着低于LDN+C组小鼠（P<0.01）。LDN+E组小鼠右侧股骨BFR/BV低于E组小鼠（P<0.05）。C组、LDN+C组和LDN+E组小鼠右侧股骨BFR/TV均低于E组小鼠（P<0.05）。C组、LDN+E组小鼠右侧股骨BFR/BS均低于E组小鼠（P<0.05）。Masson三色染色结果显示E组小鼠右侧股骨BV/TV高于C组和LDN+C组小鼠（P<0.05）。E组小鼠右侧股骨Tb.N高于C组小鼠（P<0.05）。E组小鼠右侧股骨Tb.Sp低于C组和LDN+C组小鼠（P<0.05）。（4）小鼠胫骨皮质骨和松质骨骨量结果:E组小鼠右侧胫骨皮质骨BV/TV高于C组小鼠（P<0.05）,LDN+C组小鼠右侧胫骨皮质骨BV/TV显着低于E组小鼠（P<0.01）,LDN+E组小鼠右侧胫骨皮质骨BV/TV显着高于LDN+C组小鼠（P<0.01）。LDN+C组小鼠右侧胫骨皮质骨Tb.N高于E组小鼠（P<0.05）。E组小鼠右侧胫骨皮质骨Tb.Th高于C组和LDN+C组小鼠（P<0.05）。LDN+C组小鼠右侧胫骨松质骨BMD显着低于E组小鼠（P<0.05）。（5）小鼠血清、尿液指标检测结果:LDN+C组和LDN+E组小鼠血钙含量均显着高于C组和E组小鼠（P<0.01）;LDN+E组小鼠血钙含量高于LDN+C组小鼠（P<0.05）。LDN+E组小鼠血磷含量显着高于C组和E组小鼠（P<0.01）。LDN+C组小鼠尿液中DPD/Ucr含量显着高于C组和E组小鼠（P<0.01）;LDN+E组小鼠尿液中DPD/Ucr含量高于C组和E组小鼠（P<0.05）。E组小鼠尿液中CTX-I含量显着低于C组和LDN+C组小鼠（P<0.01）,低于LDN+E组小鼠（P<0.05）。（6）小鼠胫骨内成骨细胞相关基因表达结果:LDN+C组和LDN+E组小鼠左侧胫骨内OCN mRNA的表达量比E组小鼠低（P<0.05）。（7）各组小鼠胫骨内Smad1、P38、ERK蛋白激活情况和总量的比较:C组和LDN+C组小鼠左侧胫骨内Smad1蛋白磷酸化含量均低于E组小鼠（P<0.05）。E组和LDN+E组小鼠左侧胫骨内Smad1蛋白总量均高于LDN+C组小鼠（P<0.05）。（8）小鼠BMSC中ALP染色结果以及BMSC中成骨细胞相关基因结果比较:E组小鼠BMSC向成骨细胞分化数量显着高于C组和LDN+C组小鼠（P<0.01）。LDN+C组小鼠BMSC内OCN mRNA的表达量比E组小鼠高（P<0.05）;LDN+E组小鼠BMSC内OCN mRNA的表达量均比C组、E组和LDN+C组小鼠显着增高（P<0.01）。LDN+C组和LDN+E组小鼠BMSC内OCN mRNA的表达量比E组小鼠低（P<0.05）。（9）离体血清饥饿实验结果:C组、LDN+C组和LDN+E组小鼠Smad1磷酸化蛋白激活含量均低于E组小鼠（P<0.05）。4结论（1）中等强度的跑台运动通过激活Smad1磷酸化,增加小鼠体内Smad1含量,促进生长期小鼠体内BMSC向成骨细胞分化数目的增加,提高骨形成速率抑制骨吸收速率,从而达到增加小鼠骨密度和在体骨量的结果。（2）激酶抑制剂抑制雄性生长期小鼠Smad1磷酸化,降低BMSC中调节成骨细胞特异性转录因子和靶基因的表达,以及小鼠体内BMP-Smad下游成骨细胞相关基因的表达,抑制骨形成速率促进骨吸收速率,降低小鼠骨密度和体重。（3）中等强度的跑台运动能够部分拮抗激活酶抑制剂的作用,可能是通过对Smad1磷酸化和总量、BMSC中调节成骨细胞特异性转录因子和靶基因的表达、小鼠体内BMP-Smad信号通路下游成骨细胞相关基因的表达产生影响,进而影响BMSC向成骨细胞分化的数目,作用于骨吸收速率和骨形成速率,从而对小鼠在体骨量、骨密度和体重产生影响。
雷晓华[9]（2018）在《（微）重力对小鼠胚胎干细胞体外增殖和分化影响的研究》文中进行了进一步梳理微重力对干细胞生长特性的改变和微重力对组织再生功能影响的研究已逐渐成为空间生命科学领域研究热点。尽管前期已有研究人员通过地面装置开展了大量的模拟微重力效应对干细胞的生长影响的工作,但地基模拟微重力与真正的太空微重力环境存在很大的区别。最近,美国NASA研究人员报道了一项太空干细胞的分化实验,该研究通过分析返回后小鼠拟胚体（embryoid bodies,EBs）的基因表达,发现太空微重力效应影响了小鼠EBs的分化,抑制了三胚层谱系分化基因的表达。但该研究获得的结果都是基于样品返回地面后开展的基因表达方面的分析,对于细胞在空间飞行中的生长过程,如细胞在轨期间每天的形态变化、增殖和分化的情况并不清楚。由于航天器中条件和资源限制以及飞行中无人操作,目前还缺少有效的方法能够同时对太空环境下生长的细胞或组织进行自动长时间培养和实时显微拍摄。因此,如何能够实现连续在轨观测干细胞的增殖和分化特征以及探讨空间微重力效应是否影响干细胞的增殖和分化是目前空间生命科学研究亟待探讨的问题。在本研究中,我们选取了多能性基因OCT4启动子驱动绿色荧光蛋白表达的小鼠胚胎干细胞（OCT4-GFP ESCs）、OCT4-GFP ESCs 来源的 EBs（OCT4-GFP EBs）和中内胚层分化基因 Brachyury启动子驱动绿色荧光蛋白表达的小鼠EBs（Brachyury-GFPEBs）作为模型开展微重力下干细胞培养研究。首先,我们建立了一种无血清、无饲养层的小鼠多能干细胞培养方法,在该培养体系下小鼠ESCs以悬浮状态生长,长期扩增后仍保持干细胞特性。其次,通过反复地基匹配实验和多次的演练实验,我们建立了一套适用太空条件下的细胞自动培养体系。在该自动培养体系下小鼠ESCs和小鼠EBs表现出良好的增殖和分化状态,并获得清晰的细胞图片。最后我们利用TZ-1货运飞船平台、自动细胞培养生物反应器、自动成像技术和实时数据传输等手段开展了为期15天的太空微重力下ESCs的增殖和分化实验,在国际上首次获得了太空飞行中小鼠胚胎干细胞实时生长的图片。通过实时显微摄影拍摄细胞每天在空间飞行中的生长图片,将获得太空环境下细胞生长的照片将与地面平行对照组的照片进行比对。增殖实验的研究结果显示:与地基对照组相比,空间微重力环境更有利于ESCs的增殖,细胞在太空中存活的时间更长,细胞生长15天后仍高表达OCT4。此外,空间飞行图片显示小鼠ESCs在太空环境下更倾向于三维生长。分化实验的研究结果显示:空间飞行条件下EBs能够粘附在含有细胞外基质的培养单元底部并进行扩展性生长;随着分化培养的进行,太空中培养的OCT4-GFPEBs其绿色荧光的表达有明显地下降,且Brachyury-GFPEBs在太空环境中能够出现绿色荧光的表达,这些结果表明空间微重力环境下小鼠的EBs可以进行中内胚层的分化。然而,空间飞行组中EBs的分化速度较对照组有所偏慢,太空中分化15天后Brachyury-GFP EBs仍呈现聚集样的团块,并且很多细胞团块仍然高表达Brachyury。本研究实验结果表明空间微重力有利于小鼠胚胎干细胞的三维生长并维持其干性基因表达,但空间微重力可能对小鼠EBs的分化存在一定的影响。本研究为人类了解空间微重力环境下胚胎干细胞的增殖和分化规律提供了新的证据,这一结果可能为今后利用空间微重力条件来开展干细胞的体外大量扩增以及在再生医学中利用干细胞构建具有功能的组织提供一种新思路。
郭萌萌[10]（2017）在《骨组织和细胞力学加载实验装置研制及细胞力敏感离子通道研究》文中研究说明微重力或废用情况下的骨重建失衡会导致骨质疏松症,尽管人们早已认识到骨骼会改变其结构以适应外力刺激,但其组织和细胞水平的机制仍不清楚,因此发展骨骼组织水平和细胞水平的体外力学加载实验装置并检测细胞感受力学刺激分子的表达对于阐明重建过程的力学传导机制具有重要意义。本文设计研发了空间骨组织人工重力加载与灌流培养实验装置。为了在空间微重力环境下研究重力场强度对骨组织块代谢的影响,并考虑骨组织块生长代谢的基本需求和实现生物力学加载功能,此实验装置具有如下功能:采用蠕动泵对骨组织块进行连续灌流培养以保证营养物质的充足供给和代谢废物的及时排出,同时对骨组织块进行流体剪应力刺激;采用使骨组织块做定轴圆周运动以施加向心力的方法模拟人工重力;设计电刷与滑环两个零件解决了对工作中蠕动泵的动态供电问题。最终此装置可实现对骨组织块进行人工重力和流体剪应力的同时加载。另外,本文基于此前的数值计算结果加工和改进了锥板流动腔实验装置,并通过生物实验验证了其实用性和可行性。针对小鼠来源的间充质干细胞MSC、成骨样细胞MC3T3-E1、骨细胞前体细胞MLO-A5和骨细胞MLO-Y4等四种细胞,利用此实验装置研究了流体剪应力对细胞内Piezo1表达的影响。对上述四种细胞分别施加不同强度的流体剪应力,并在不同时间点应用实时荧光定量聚合酶链式反应技术研究Piezo1在m RNA水平上的表达情况。研究结果显示,四种细胞内均表达Piezo1和Piezo2。流体剪应力刺激后,四种细胞的Piezo1表达呈现先升高后降低的趋势,MSC、MC3T3-E1和MLO-A5等三种细胞在流体剪应力连续刺激1 h时,Piezo1表达水平达到峰值,MLO-Y4在0.5 h时达到峰值,并且1.1 Pa流体剪应力刺激下的表达水平显着高于0.1 Pa。Piezo1表达依赖于细胞种类,其中在MC3T3-E1细胞的表达量高于其它三种细胞。本文研发的新型空间骨组织人工重力加载与灌流培养实验装置可为体外研究重力场强度对骨组织块代谢的影响提供实验装置支持,并且细胞流体剪应力加载实验结果显示Piezo1的表达与成骨分化过程、流体剪应力加载强度和加载时间相关,对于揭示骨组织细胞内力学信号的传导机制具有重要意义。
二、1G和模拟微重力下前列腺癌细胞PC-3对小鼠成骨样细胞MC3T3-E1增殖和活性的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、1G和模拟微重力下前列腺癌细胞PC-3对小鼠成骨样细胞MC3T3-E1增殖和活性的影响（论文提纲范文）
（1）仙灵骨葆胶囊通过miR-100-5p/JMJD3/RUNX2促进成骨细胞分化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 中医中药对骨质疏松的治疗进展 |
| 一、中医中药对骨质疏松病因病机的认识 |
| 二、中医中药对骨质疏松的治法与方药 |
| 第二节 骨形成的分子机制研究进展 |
| 一、蛋白因子与蛋白信号通路 |
| 二、非编码RNA调控网络 |
| 第三节 抗骨质疏松中药促进骨形成的分子机制研究进展 |
| 第四节 仙灵骨葆胶囊抗骨质疏松机制 |
| 第五节 组蛋白修饰与骨质疏松 |
| 第二章 JMJD3和RUNX2 在骨质疏松患者骨组织中的表达水平分析 |
| 第一节 研究背景 |
| 第二节 材料和方法 |
| 一、临床研究对象 |
| 二、实验试剂和仪器 |
| 三、实验方法和步骤 |
| 第三节 研究结果 |
| 一、两组研究对象一般资料相关性分析 |
| 二、骨组织中JMJD3和RUNX2的m RNA表达水平检测 |
| 三、骨组织中JMJD3、H3K27me3和RUNX2 的蛋白表达水平检测 |
| 四、JMJD3、H3K27me3和RUNX2 在骨组织中的表达水平与研究对象临床信息的相关性分析 |
| 第四节 讨论 |
| 第三章 仙灵骨葆通过上调JMJD3/RUNX2 通路促进成骨细胞分化 |
| 第一节 研究背景 |
| 第二节 材料和方法 |
| 一、细胞材料 |
| 二、试剂和仪器 |
| 三、方法和步骤 |
| 第三节 研究结果 |
| 一、不同浓度仙灵骨葆胶囊对MC3T3-E1 细胞增殖的影响 |
| 二、不同仙灵骨葆胶囊浓度对MC3T3-E1 成骨分化的影响 |
| 三、仙灵骨葆胶囊促进JMJD3/RUNX2 通路激活 |
| 四、抑制JMJD3/RUNX2 通路可以缓解仙灵骨葆胶囊对成骨细胞分化的促进作用 |
| 第四节 讨论 |
| 第四章 成骨细胞中仙灵骨葆胶囊通过抑制miR-100-5p上调JMJD3 的表达 |
| 第一节 研究背景 |
| 第二节 材料和方法 |
| 一、细胞材料 |
| 二、试剂和仪器 |
| 三、方法和步骤 |
| 第三节 研究结果 |
| 一、仙灵骨葆胶囊抑制MC3T3-E1 细胞中miR-100-5p的表达 |
| 二、荧光素酶报告基因系统检测miR-100-5p与 JMJD3 的结合 |
| 三、转染miR-100-5p拟似物可缓解仙灵骨葆胶囊对JMJD3 表达的促进作用 |
| 四、转染miR-100-5p拟似物可缓解仙灵骨葆胶囊对成骨细胞分化的促进作用 |
| 第四节 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（2）骨粘连蛋白通过p38MAPK通路调控成骨细胞矿化的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 成骨细胞的分离、培养与鉴定 |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第二部分 骨粘连蛋白影响成骨细胞矿化期非胶原蛋白基因的表达 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第三部分 骨粘连蛋白对其它矿化指标的影响及SB203580的阻断效应 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第四部分 AD-p38及p38-rhRNA病毒载体构建 |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第五部分: P38 MAPK在骨粘连蛋白调控成骨细胞矿化中信号通路作用的进一步研究 |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 生物矿化及仿生的机制研究及应用 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 攻读博士期间发表文章一览表 |
| 致谢 |
（3）雷帕霉素改善铁蓄积高转换骨质疏松中“骨生成/血管形成”的基础研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 一、骨代谢的组成 |
| 二、骨代谢与骨质疏松 |
| 三、铁蓄积与骨质疏松 |
| 四、mTOR与铁蓄积骨质疏松 |
| 参考文献 |
| 第一部分 铁蓄积对小鼠、成骨细胞中mTOR水平及小鼠骨量的影响 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 雷帕霉素在铁蓄积高转换骨质疏松中的骨生成作用 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 雷帕霉素在铁蓄积高转换骨质疏松中的血管形成作用 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 雷帕霉素改善铁蓄积高转换骨质疏松的机制研究 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述1 铁稳态对 mTOR 信号通路的影响 |
| 参考文献 |
| 综述2 mTOR 信号通路及在间充质干细胞中的调控 |
| 参考文献 |
| 综述3 mTOR 和骨代谢关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英汉主要缩略词表 |
| 在读期间撰写论文及科研情况 |
| 致谢 |
（4）HIF-1α在低氧诱导的成骨细胞RANKL表达中作用及低氧下红景天苷对破骨细胞HIF-1α通路调控作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 HIF-1α在低氧诱导的成骨细胞RANKL表达中的作用 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 低氧对成骨细胞RANKL基因和蛋白表达的影响 |
| 2.2 HIF-1α抑制剂YC-1 对低氧诱导的成骨细胞RANKL基因和蛋白表达的影响 |
| 2.3 内源性过表达或抑表达HIF-1α对成骨细胞RANKL基因和蛋白表达的影响 |
| 2.4 低氧下HIF-1α对成骨细胞RANKL转录活性的影响 |
| 2.5 低氧对成骨细胞中HIF-1α与 RANKL启动子结合能力的影响 |
| 3 小结 |
| 第二部分 低氧下红景天苷对破骨细胞HIF-1α通路相关分子表达的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 低氧下红景天苷对破骨细胞HIF-1α、pVHL、VEGF、ANGPTL4、IL-6和mi R-20a表达的影响 |
| 2.2 RANKL和 M-CSF诱导RAW264.7 细胞分化为成熟破骨细胞的TRAP染色结果 |
| 2.3 低氧下红景天苷对RANKL和 M-CSF诱导的RAW264.7 细胞HIF-1α、pVHL、VEGF、ANGPTL4、IL-6和mi R-20a表达的影响 |
| 2.4 小鼠骨髓原代破骨前体细胞的提取与鉴定 |
| 2.5 小鼠骨髓原代破骨前体细胞CoCl2模拟低氧浓度的确定 |
| 2.6 低氧下红景天苷对小鼠骨髓原代破骨细胞HIF-1α、pVHL、VEGF、ANGPTL4、IL-6和mi R-20a表达的影响 |
| 3 小结 |
| 第三部分 低氧下红景天苷对破骨细胞HIF-1α核转位及转录活性的作用 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 低氧下红景天苷对破骨细胞HIF-1α核转位的影响 |
| 2.2 低氧下红景天苷对破骨细胞HIF-1α转录活性的影响 |
| 3 小结 |
| 第四部分 HIF-1α抑制剂YC-1 对低氧下红景天苷介导破骨细胞HIF-1α通路作用的阻断 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 YC-1 对低氧下红景天苷介导破骨细胞HIF-1α、pVHL、VEGF、ANGPTL4、IL-6和miR-20a表达作用的影响 |
| 2.2 YC-1 对低氧下红景天苷介导破骨细胞HIF-1α核转位作用的影响 |
| 2.3 YC-1 对低氧下红景天苷介导破骨细胞HIF-1α转录活性作用的影响 |
| 3 小结 |
| 讨论 |
| 1 HIF-1α在低氧诱导的成骨细胞RANKL表达中的作用 |
| 2 低氧下红景天苷对破骨细胞HIF-1α通路的调控作用 |
| 3 总结与展望 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 红景天苷药理作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历与科研成果 |
（5）高重力对成骨细胞与骨重建的影响及其机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 课题立题依据、意义 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.3 研究内容与方法 |
| 1.4 技术路线 |
| 1.5 课题的创新性 |
| 1.6 参考文献 |
| 第二章 高G加载对小鼠MC3T3-E1细胞形态学的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 细胞 |
| 2.2.2 主要试剂及仪器 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 高G加载后成骨细胞形态的变化 |
| 2.3.2 高G加载后成骨细胞微丝骨架的变化 |
| 2.3.3 高G加载后成骨细胞超微结构的变化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 小鼠MC3T3-E1细胞形态特点和生长特征 |
| 2.4.2 超重环境对小鼠MC3T3-E1细胞形态的影响 |
| 2.5 本章小结 |
| 2.6 参考文献 |
| 第三章 高G加载对小鼠MC3T3-E1细胞生物学功能的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 细胞 |
| 3.2.2 主要试剂及仪器 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 高G加载对成骨细胞增殖的影响 |
| 3.3.2 高G加载对成骨细胞凋亡的影响 |
| 3.3.3 高G加载对成骨细胞分化的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 超重环境对成骨细胞增殖的影响 |
| 3.4.2 超重环境对成骨细胞凋亡的影响 |
| 3.4.3 超重环境对成骨细胞分化的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 3.6 参考文献 |
| 第四章 高G环境下小鼠MC3T3-E1细胞的基因组学研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 细胞 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.2.4 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 高G环境下小鼠MC3T3-E1细胞总RNA质检结果 |
| 4.3.2 高G环境下小鼠MC3T3-E1细胞长链非编码RNA芯片检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 超重环境对骨重建的影响 |
| 4.4.2 lncRNAs对成骨细胞的作用 |
| 4.4.3 超重环境下小鼠MC3T3-E1细胞基因组学研究结果的分析 |
| 4.4.4 高重力敏感候选lncRNA的选择及分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 4.6 参考文献 |
| 第五章 高G环境下小鼠MC3T3-E1细胞的蛋白组学研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 细胞 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.2.3 主要试剂 |
| 5.2.4 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 高G环境下小鼠MC3T3-E1细胞蛋白质质检结果 |
| 5.3.2 高G环境下小鼠MC3T3-E1细胞蛋白质谱定量统计结果 |
| 5.3.3 高G环境对小鼠MC3T3-E1细胞蛋白表达变化的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 蛋白质组学产生的背景及其概念 |
| 5.4.2 蛋白质组学研究技术 |
| 5.4.3 超重环境下小鼠MC3T3-E1细胞蛋白质组学研究结果的分析 |
| 5.5 本章小结 |
| 5.6 参考文献 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 课题的局限性与展望 |
| 附录A 长链非编码RNA芯片实验过程 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（6）微重力环境对成骨细胞的影响及机制的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 国内外研究现状 |
| 1.1.1 微重力环境下骨组织损伤、修复与重建 |
| 1.1.2 长链非编码RNA在骨重建过程的作用 |
| 1.1.3 小RNA在骨重建过程的作用 |
| 1.1.4 环状RNA在骨重建过程的作用 |
| 1.2 研究目的意义 |
| 1.2.1 研究目的 |
| 1.2.2 研究意义 |
| 1.3 研究内容与方法 |
| 1.3.1 研究内容 |
| 1.3.2 研究方法 |
| 1.4 技术路线与实验安排 |
| 1.4.1 总实验技术路线 |
| 1.4.2 实验进度安排 |
| 1.5 课题研究特色与创新点 |
| 1.5.1 本课题的特色之处 |
| 1.5.2 本课题的创新点 |
| 参考文献 |
| 第二章 地基微重力环境模型的建立 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.2.4 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 微重力环境对小鼠后肢胫骨力学性能与微观结构的影响 |
| 2.3.2 微重力环境下细胞与微载体的贴附结果 |
| 2.3.3 微重力环境对成骨细胞增值的影响 |
| 2.3.4 微重力环境对成骨细胞分化的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于RNA测序微重力环境下成骨细胞LncRNA、miRNA、CircRNA、mRNA转录调控的研究 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验试剂： |
| 3.2.3 实验耗材与仪器： |
| 3.2.4 实验设计 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 样品RNA的制备与质检 |
| 3.3.2 建立LncRNA、CircRNA文库 |
| 3.3.3 建立miRNA文库 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 实验样品RNA质检 |
| 3.4.2 LncRNA-mRNA分析 |
| 3.4.3 miRNA-mRNA分析 |
| 3.4.4 CircRNA-mRNA分析 |
| 3.4.5 CeRNA预测 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 微重力环境下NF-κB信号通路对细胞成骨分化影响的初步研究 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料与试剂 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.3 统计方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 微重力环境下细胞与微载体的贴附 |
| 4.3.2 微重力对MC3T3-E1 细胞成骨相关性基因和蛋白的表达水平影响 |
| 4.3.3 微重力环境下对BMP/Smad通路的调控 |
| 4.3.4 NF-κB信号通路对微重力环境的响应 |
| 4.3.5 微重力环境下细胞炎性因子IL-6 的表达情况 |
| 4.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 CRISPR/Cas9 技术构建MC3T3-E1 细胞骨负调控因子CKIP-1 基因敲除稳定株系 |
| 5.1 研究背景 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 材料与试剂 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 MC3T3-E1 细胞电转条件、最小全致死浓度及单克隆生长 |
| 5.3.2 敲除载体构建 |
| 5.3.3 CRISPR/Cas9 敲除结果分析 |
| 5.3.4 72#杂合子PCR验证CKIP-1表达 |
| 5.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 全文总结与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 展望 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（7）模拟失重下破骨源性外泌体中骨形成相关miRNAs的高通量分析研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 研究背景及意义 |
| 1.2 空间失重性骨质流失细胞学机制的研究进展 |
| 1.2.1 破骨细胞和成骨细胞在失重性骨质流失中的作用 |
| 1.2.2 失重环境对破骨细胞功能影响的研究进展 |
| 1.2.3 失重环境对成骨细胞功能影响的研究进展 |
| 1.2.4 破骨细胞对成骨细胞调控的研究进展 |
| 1.3 外泌体miRNAs介导骨组织细胞间通讯的研究进展 |
| 1.3.1 外泌体介导的细胞通讯 |
| 1.3.2 microRNA在细胞通讯中的重要作用 |
| 1.4 高通量测序技术及其数据挖掘 |
| 1.4.1 miRNA表达谱高通量测序技术 |
| 1.4.2 miRNA高通量测序数据分析工具与数据库 |
| 1.5 研究内容 |
| 1.5.1 本论文研究内容 |
| 1.5.2 本论文研究技术路线 |
| 2 模拟失重条件下破骨源性外泌体的提取鉴定及其对成骨细胞的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.2.4 随机回转模拟失重系统及其生物学效应 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 随机回转仪培养RAW264.7 细胞 |
| 2.3.3 破骨细胞形成及活性检测 |
| 2.3.4 破骨源性外泌体的提取及鉴定 |
| 2.3.5 破骨源性外泌体对成骨细胞的影响 |
| 2.3.6 统计处理 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 RPM培养系统对破骨细胞形成及活性的影响 |
| 2.4.2 破骨源性外泌体的分离鉴定 |
| 2.4.3 MC3T3-E1 细胞摄取破骨源性外泌体的分析 |
| 2.4.4 破骨源性外泌体对MC3T3-E1 细胞增殖的影响 |
| 2.4.5 破骨源性外泌体对MC3T3-E1 细胞ALP活性的影响 |
| 2.4.6 破骨源性外泌体对MC3T3-E1 细胞矿化的影响 |
| 2.4.7 破骨源性外泌体对MC3T3-E1 细胞周期的影响 |
| 2.4.8 破骨源性外泌体对MC3T3-E1 细胞凋亡的影响 |
| 2.4.9 破骨源性外泌体对MC3T3-E1 细胞成骨分化相关基因表达的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 3 模拟失重条件下破骨源性外泌体中miRNAs高通量测序分析及表达谱的构建 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.2.4 实验方法 |
| 3.2.5 统计处理 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 原始数据质量分析和质量控制 |
| 3.3.2 公共及特有序列分析 |
| 3.3.3 sRNA分类注释 |
| 3.3.4 已知miRNAs表达分析 |
| 3.3.5 新miRNAs预测 |
| 3.3.6 样品间已知miRNAs差异表达分析 |
| 3.3.7 已知miRNAs表达聚类分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 模拟失重条件下破骨源性外泌体中骨形成相关显着差异miRNAs靶基因预测及生物信息学分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.2.4 生物信息学分析工具及在线数据库 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 骨形成相关miRNAs的初步筛选 |
| 4.3.2 miRNAs聚类分析 |
| 4.3.3 miRNAs的靶基因预测 |
| 4.3.4 GO富集分析和KEGG Pathway分析 |
| 4.3.5 随机回转仪培养RAW264.7 细胞 |
| 4.3.6 破骨源性外泌体miRNAs的提取及纯度测定 |
| 4.3.7 miRNAs反转录及实时荧光定量PCR |
| 4.3.8 统计处理 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 骨形成相关10个miRNAs的聚类分析 |
| 4.4.2 miRNAs靶基因预测 |
| 4.4.3 靶基因GO富集分析 |
| 4.4.4 KEGG Pathway分析 |
| 4.4.5 骨形成相关miRNAs的 RT-q PCR验证 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文和参加科研情况 |
| 致谢 |
（8）跑台运动对生长期小鼠骨髓间充质干细胞BMP-Smad信号通路的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 2 文献综述 |
| 参考文献 |
| 3 材料和方法 |
| 第一部分 实验 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.2 第一部分实验技术路线图 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 小鼠饲养与分组 |
| 3.3.2 跑台训练方案 |
| 3.3.3 取材方法 |
| 3.3.4 指标检测方法 |
| 3.4 统计学方法 |
| 第二部分 实验 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.2 第二部分实验技术路线图 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 小鼠饲养与分组 |
| 3.3.2 跑台训练方案 |
| 3.3.3 激活酶抑制剂注射 |
| 3.3.4 取材方法 |
| 3.3.5 指标检测方法 |
| 3.4 统计学方法 |
| 4 结果 |
| 第一部分 实验结果 |
| 4.1 运动可提高小鼠股骨BMD和在体骨量 |
| 4.2 运动可激活小鼠骨形态发生蛋白信号通路(BMPS) |
| 第二部分 实验结果 |
| 4.3 干预期间小鼠体重变化情况 |
| 4.4 各组小鼠股骨BMD和骨生物力学指标检测结果比较 |
| 4.5 各组小鼠股骨骨组织形态计量学检测指标结果比较 |
| 4.6 各组小鼠胫骨皮质骨和松质骨在体骨量结果比较 |
| 4.7 各组小鼠血清、尿液指标检测结果比较 |
| 4.8 各组小鼠胫骨内相关成骨细胞基因表达量比较 |
| 4.9 各组小鼠胫骨内Smad1、P38、ERK蛋白的激活情况和总量的比较 |
| 4.10 小鼠BMSC ALP染色结果以及BMSC中相关成骨细胞基因表达量结果比较 |
| 4.11 离体血清饥饿实验结果 |
| 5 分析与讨论 |
| 5.1 跑台运动可以激活小鼠骨骼中BMP-Smad信号通路 |
| 5.2 小鼠品系的选择和造模的鼠龄 |
| 5.3 中等强度的跑台运动对小鼠体重无影响,但能够促进骨形成抑制骨吸收 |
| 5.3.1 跑台运动对小鼠体重、股骨BMD和生物力学指标的影响 |
| 5.3.2 跑台运动对小鼠股骨和胫骨在体骨量指标的影响 |
| 5.3.3 跑台运动对小鼠血液和尿液骨代谢生物化学指标的影响 |
| 5.3.4 跑台运动对小鼠胫骨内成骨细胞相关基因和蛋白的影响 |
| 5.3.5 跑台运动对小鼠BMSCs ALP染色、成骨细胞相关基因、血清饥饿实验的影响 |
| 5.4 激酶抑制剂的注射降低小鼠体重,减少骨密度,降低骨形成率,促进骨吸收 |
| 5.4.1 激酶抑制剂的注射对小鼠体重、股骨BMD和生物力学指标的影响 |
| 5.4.2 激酶抑制剂的注射对小鼠股骨和胫骨在体骨量指标的影响 |
| 5.4.3 激酶抑制剂注射对小鼠血液和尿液骨代谢生物化学指标的影响 |
| 5.4.4 激酶抑制剂注射对小鼠胫骨内成骨细胞相关基因和蛋白的影响 |
| 5.4.5 激酶抑制剂注射对小鼠BMSCs ALP染色、成骨细胞基因、血清饥饿实验的影响 |
| 6 结论 |
| 7 参考文献 |
| 致谢 |
| 附件 |
（9）（微）重力对小鼠胚胎干细胞体外增殖和分化影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 生物机械力及力学信号在干细胞命运调控中的功能与作用 |
| 1.1.1 细胞微环境及生物机械力 |
| 1.1.2 生物机械力对干细胞增殖、分化的影响 |
| 1.1.3 干细胞响应力学信号和力学信号转导的机制 |
| 1.2 微重力环境及地基模拟微重力装置 |
| 1.2.1 1.2.1微重力环境 |
| 1.2.2 地基模拟微重力平台和装置 |
| 1.2.3 模拟微重力概念在细胞三维培养应用 |
| 1.2.4 空间微重力研究平台 |
| 1.3 微重力效应对干细胞增殖、分化影响的研究 |
| 1.3.1 地基模拟微重力效应对干细胞增殖、分化研究 |
| 1.3.2 空间微重力条件下干细胞的增殖、分化研究 |
| 1.3.3 微重力条件下干细胞的增殖和分化研究的总结和展望 |
| 1.4 本研究的研究目的和意义 |
| 第二章 实验材料和方法 |
| 2.1 空间飞行前地基实验材料和制备方法 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 实验试剂及配制 |
| 2.1.5 实验方法 |
| 2.2 空间飞行实验样品制备、加载和分析方法 |
| 2.2.1 实验样品、材料及设备准备 |
| 2.2.2 实验组别设计 |
| 2.2.3 空间实验流程 |
| 2.2.4 细胞生长面积分析 |
| 2.2.5 图像荧光强度分析 |
| 2.2.6 统计方法 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 小鼠ESCs无血清、无饲养悬浮培养体系的建立 |
| 3.1.1 无血清、无饲养层的悬浮培养体系下小鼠ESCs的生长特征 |
| 3.1.2 长期悬浮培养对小鼠ESCs干性维持和染色体核型的影响 |
| 3.1.3 长期悬浮培养对小鼠ESCs体外分化和体内分化的影响 |
| 3.1.4 悬浮培养有利于去除小鼠ESCs中杂细胞或已分化的细胞 |
| 3.2 Brachyury-GFP小鼠ESCs的构建 |
| 3.2.1 建立Brachyury-GFP的小鼠ESCs |
| 3.3 发射前地基模拟实验及相关匹配实验结果 |
| 3.3.1 空间培养单元的生物相容性测试实验 |
| 3.3.2 细胞样品自动成像捕获测试的结果 |
| 3.3.3 地基条件下整合匹配实验结果 |
| 3.4 空间微重力环境对小鼠胚胎干细胞增殖和拟胚体分化的影响 |
| 3.4.1 空间微重力有利于小鼠ESCs的生长和长期存活 |
| 3.4.2 空间微重力维持小鼠ESCs多能性标志分子的表达和促进细胞三维生长 |
| 3.4.3 空间微重力环境对拟胚体粘附、扩展和分化特征的影响 |
| 3.4.4 空间微重力环境对拟胚体中内胚层分化的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 博士期间发表论文 |
（10）骨组织和细胞力学加载实验装置研制及细胞力敏感离子通道研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 本文研究背景及意义 |
| 1.2 骨组织细胞及骨重建 |
| 1.3 骨组织细胞力学微环境 |
| 1.4 国内外研究现状 |
| 1.4.1 空间生物组织培养反应器 |
| 1.4.2 细胞流体剪应力加载实验手段 |
| 1.4.3 力敏感通道离子通道 |
| 1.5 本文主要研究内容 |
| 第2章 空间骨组织人工重力加载与灌流培养实验装置设计 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验装置设计目标 |
| 2.3 实验装置结构系统设计 |
| 2.3.1 灌流系统 |
| 2.3.2 加载系统 |
| 2.3.3 固定系统 |
| 2.4 实验装置动力系统设计 |
| 2.5 实验装置设计中关键技术研究 |
| 2.5.1 实现动态供电 |
| 2.5.2 方便安装拆卸 |
| 2.5.3 防止偏心振动 |
| 2.6 实验装置加工及装配 |
| 2.7 实验装置测试 |
| 2.8 本章小结 |
| 第3章 锥板流动腔实验装置的优化设计与应用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验装置结构优化设计 |
| 3.3 实验装置动力系统设计 |
| 3.4 实验装置加工及装配 |
| 3.5 六孔板底面流场强度模拟计算 |
| 3.6 实验装置应用中关键技术研究 |
| 3.6.1 间隙精度问题 |
| 3.6.2 接种区域问题 |
| 3.6.3 消毒灭菌问题 |
| 3.7 实验装置使用操作步骤 |
| 3.8 本章小结 |
| 第4章 流体剪应力对成骨向细胞PIEZO1表达的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 实验细胞 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 主要仪器与设备 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 流体剪应力体外细胞加载实验 |
| 4.3.3 PCR检测细胞Piezo表达实验 |
| 4.3.4 实验分组 |
| 4.3.5 数据处理 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 细胞形态学观察 |
| 4.4.2 两种PCR技术比较 |
| 4.4.3 四种细胞内表达Piezo1和Piezo2 |
| 4.4.4 流体剪应力强度与时间对Piezo1表达的影响 |
| 4.4.5 Piezo1表达依赖于细胞种类 |
| 4.5 结果讨论与分析 |
| 4.6 本章小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文与研究成果清单 |
| 致谢 |
四、1G和模拟微重力下前列腺癌细胞PC-3对小鼠成骨样细胞MC3T3-E1增殖和活性的影响（论文参考文献）
- [1]仙灵骨葆胶囊通过miR-100-5p/JMJD3/RUNX2促进成骨细胞分化的研究[D]. 艾亮. 广州中医药大学, 2020(09)
- [2]骨粘连蛋白通过p38MAPK通路调控成骨细胞矿化的研究[D]. 朱云森. 苏州大学, 2020(06)
- [3]雷帕霉素改善铁蓄积高转换骨质疏松中“骨生成/血管形成”的基础研究[D]. 吴加东. 苏州大学, 2020(06)
- [4]HIF-1α在低氧诱导的成骨细胞RANKL表达中作用及低氧下红景天苷对破骨细胞HIF-1α通路调控作用的研究[D]. 高丹丹. 天津中医药大学, 2020(04)
- [5]高重力对成骨细胞与骨重建的影响及其机理研究[D]. 韦淑萍. 军事科学院, 2019(09)
- [6]微重力环境对成骨细胞的影响及机制的实验研究[D]. 韩标. 军事科学院, 2019(09)
- [7]模拟失重下破骨源性外泌体中骨形成相关miRNAs的高通量分析研究[D]. 杜勇勇. 西北工业大学, 2019
- [8]跑台运动对生长期小鼠骨髓间充质干细胞BMP-Smad信号通路的影响[D]. 张玲莉. 上海体育学院, 2019(01)
- [9]（微）重力对小鼠胚胎干细胞体外增殖和分化影响的研究[D]. 雷晓华. 中国农业大学, 2018(12)
- [10]骨组织和细胞力学加载实验装置研制及细胞力敏感离子通道研究[D]. 郭萌萌. 北京理工大学, 2017(07)